ప్రపంచవ్యాప్త ఆహార కొరతను పరిష్కరించడంలో మరియు వాహక-జనిత మానవ వ్యాధులను ఎదుర్కోవడంలో పురుగుమందులు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి. అయితే, పెరుగుతున్న పురుగుమందుల నిరోధకత సమస్య, తక్కువగా ఉపయోగించబడుతున్న లక్ష్యాలను ఛేదించే కొత్త సమ్మేళనాలను కనుగొనడాన్ని అత్యవసరంగా కోరుతోంది. కీటకాల తాత్కాలిక గ్రాహక సంభావ్య (TRPV) ఛానెల్లు—నాన్జోంగ్ (Nan) మరియు క్రియారహిత (Iav)—విషమజాతీయ ఛానెల్లను (Nan-Iav) ఏర్పరచగలవు మరియు కీటకాలలో భూమి వైపు కదలడం (జియోట్రోపిజం), వినికిడి మరియు శరీర స్థితి గ్రహణాన్ని (ప్రొప్రియోసెప్షన్) మధ్యవర్తిత్వం చేసే యాంత్రిక-ఇంద్రియ అవయవాలలో స్థానికీకరించబడతాయి. అఫిడోపైరోలిడోన్ (AP) వంటి కొన్ని పురుగుమందులు, తెలియని యంత్రాంగాల ద్వారా Nan-Iavను లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి. AP కుట్టి-పీల్చే కీటకాలకు (హెమిప్టెరాన్స్) వ్యతిరేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది, వాటి తంతువుల పనితీరును దెబ్బతీయడం ద్వారా ఆహారం తీసుకోవడాన్ని నిరోధిస్తుంది. AP కేవలం Nanకు మాత్రమే బంధించగలదు, కానీ Nan-Iav మాత్రమే అంతర్గత నికోటినామైడ్ (NAM)తో సహా అగోనిస్టులతో సంకర్షణ చెందగలదు, తద్వారా ఛానెల్ క్రియాశీలతను ప్రదర్శిస్తుంది. కీటకనాశక లక్ష్యంగా నాన్-ఐఏవికి సామర్థ్యం ఉన్నప్పటికీ, దాని ఛానల్ నిర్మాణం, నియంత్రణ బంధన స్థానాలు మరియు Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ గురించి పెద్దగా తెలియదు, ఇది తదుపరి కీటకనాశక అభివృద్ధికి ఆటంకం కలిగిస్తోంది. ఈ అధ్యయనంలో, హెమిప్టెరా కీటకాలలో కాల్మోడ్యులిన్-లిగాండ్-రహిత స్థితిలో, అలాగే యాంకిరిన్ రిపీట్ సైటోప్లాస్మిక్ డొమైన్ (ARD) సరిహద్దు వద్ద AP మరియు NAM ఉన్నప్పుడు నాన్-ఐఏవి నిర్మాణాన్ని నిర్ధారించడానికి క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించారు. ఆశ్చర్యకరంగా, నాన్ ప్రోటీన్ స్వయంగా ఒక పెంటామర్ను ఏర్పరచగలదని, ఇది AP-మధ్యవర్తిత్వ ARD పరస్పర చర్యల ద్వారా స్థిరీకరించబడుతుందని మేము కనుగొన్నాము. ఈ అధ్యయనం కీటకనాశకాలు, అగోనిస్టులు మరియు నాన్-ఐఏవి మధ్య పరమాణు పరస్పర చర్యలను వెల్లడిస్తుంది, ఛానల్ పనితీరు మరియు నిర్మాణంలో ARD ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది మరియు Ca2+ నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని అన్వేషిస్తుంది.
రోజురోజుకూ తీవ్రమవుతున్న ప్రపంచ వాతావరణ మార్పుల నేపథ్యంలో, క్షీణిస్తున్న ప్రపంచ ఆహార భద్రత 21వ శతాబ్దపు ప్రధాన సవాళ్లలో ఒకటిగా నిలిచింది, ఇది సమాజంపై అనేక పరిణామాలకు దారితీస్తోంది.1,2ప్రపంచ ఆరోగ్య సంస్థ యొక్క 'స్టేట్ ఆఫ్ ఫుడ్ సెక్యూరిటీ అండ్ న్యూట్రిషన్ ఇన్ ది వరల్డ్ 2023 (SOFI)' నివేదిక ప్రకారం, ప్రపంచవ్యాప్తంగా సుమారు 2.33 బిలియన్ల మంది ప్రజలు మధ్యస్థం నుండి తీవ్రమైన ఆహార అభద్రతతో బాధపడుతున్నారు, ఇది చాలా కాలంగా ఉన్న సమస్య.3,4దురదృష్టవశాత్తు, తెగుళ్లు మరియు వ్యాధికారకాల వల్ల ఏటా సుమారు 20% నుండి 30% లేదా అంతకంటే ఎక్కువ పంట దిగుబడి నష్టపోతోంది, మరియు గ్లోబల్ వార్మింగ్ తెగుళ్ల నిరోధకతను, పంటల దుర్బలత్వాన్ని మరింత తీవ్రతరం చేస్తుందని అంచనా వేయబడింది.4,5,6,7,8పంటలను తెగుళ్ల నుండి రక్షించడానికి, వాహకాల ద్వారా వ్యాపించే వ్యాధికారకాల వ్యాప్తిని తగ్గించడానికి మాత్రమే కాకుండా, పురుగుమందులకు నిరోధకతను పెంచుకుంటున్న డెంగ్యూ జ్వరం, మలేరియా, చాగస్ వ్యాధి వంటి వాహకాల ద్వారా వ్యాపించే మానవ వ్యాధులను ఎదుర్కోవడానికి కూడా పురుగుమందుల అభివృద్ధి అత్యంత కీలకం.5,9,10,11
న్యూరోటాక్సిక్ పురుగుమందుల యొక్క ప్రధాన లక్ష్యాలలో, హెటెరోటెట్రామెరిక్ TRPV ఛానెల్ నాన్చుంగ్ (Nan)-ఇనాక్టివ్ (Iav) అనేది గత దశాబ్దంలో మాత్రమే కనుగొనబడిన ఒక రకమైన పురుగుమందుల లక్ష్యాలను సూచిస్తుంది, వీటిలో ఇమిడాక్లోప్రిడ్ మరియు పైరాక్లోస్ట్రోబిన్ వంటి వాణిజ్యపరంగా లభించే పురుగుమందులు కూడా ఉన్నాయి.12,13,14అఫిడోపైరోలిఫెన్ (AP) అనే సెమీసింథటిక్ కీటకనాశిని ఇటీవల అభివృద్ధి చేయబడి, వాణిజ్యపరంగా అందుబాటులోకి వచ్చిన ఒక ఉత్పత్తి. దీని ప్రధాన భాగం ఇన్స్కాలిస్® అనే క్రియాశీల కీటకనాశిని, ఇది APతో సబ్నానోమోలార్ క్రియాశీలత స్థాయిలో బంధించబడుతుంది.15AP పరాగసంపర్క కారకాలు, ప్రయోజనకరమైన కీటకాలు మరియు ఇతర లక్ష్యం కాని జీవులపై తక్కువ తీవ్ర విష ప్రభావాన్ని చూపుతుంది మరియు లేబుల్ సూచనల ప్రకారం ఉపయోగించినప్పుడు, ఇది ఇతర పురుగుమందులపై నిరోధక ఒత్తిడిని తగ్గించగలదు.16,17,18Nan మరియు Iav అనేవి కీటక జాతులలో విస్తృతంగా వ్యాపించి ఉంటాయి, కేవలం యాంటెన్నాలు మరియు అవయవాలలోని కార్డల్ స్ట్రెచ్ రిసెప్టర్ న్యూరాన్లలో మాత్రమే కలిసి వ్యక్తమవుతాయి, మరియు వినికిడి, గురుత్వాకర్షణ గ్రహణశక్తి, మరియు ప్రొప్రియోసెప్షన్కు కీలకమైనవి.13,16,19,20,21,22AP, ఇమిడాక్లోప్రిడ్ మరియు పైరాక్లోస్ట్రోబిన్ ఒక ప్రత్యేకమైన యంత్రాంగం ద్వారా Nan-Iav కాంప్లెక్స్ను ఉత్తేజపరుస్తాయి, అంతిమంగా ప్రొప్రియోసెప్టివ్ సిగ్నల్ ట్రాన్స్డక్షన్ను నిరోధిస్తాయి.13,16,23పేనుబంక మరియు తెల్లదోమల వంటి కుట్టి రసం పీల్చే కీటకాలలో (హెమిప్టెరాన్లు), శరీర స్థితిని గ్రహించే శక్తిని కోల్పోవడం వాటి ఆహార సేకరణ సామర్థ్యాన్ని దెబ్బతీస్తుంది, ఇది చివరికి మరణానికి దారితీస్తుంది.13,24ఆసక్తికరంగా, AP అనేది Nan-Iav కాంప్లెక్స్ పట్ల అధిక అనుబంధాన్ని మరియు కేవలం Nan పట్ల తక్కువ అనుబంధాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది. AP, Nan-Iavకు బంధించడం వలన విద్యుత్ ప్రవాహం ప్రేరేపించబడుతుంది, కానీ కేవలం Nanకు బంధించడం ఛానల్ కార్యాచరణను ప్రేరేపించదు. Iav స్వయంగా APకి అస్సలు బంధించదు.16దీనిని బట్టి, Nan మరియు Iav బంధించబడి వేర్వేరు Nan-Iav ఛానల్ కాంప్లెక్స్లను (ఉదాహరణకు, వేర్వేరు స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తులతో లేదా ఒకే స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తిలో వేర్వేరు అమరికలతో) ఏర్పరుస్తాయని లేదా AP బహుళ ప్రదేశాలకు బంధించవచ్చని తెలుస్తుంది. అంతేకాకుండా, సహజ అగోనిస్ట్ నికోటినమైడ్ (NAM) డ్రోసోఫిలా Nan-Iavకు మైక్రోమోలార్ అఫినిటీతో బంధిస్తుంది, ఇది ఇన్ విట్రోలో అఫిడ్స్ (AP) యొక్క ప్రభావాలను పోలిన ప్రభావాలను ప్రదర్శిస్తుంది.16,25మరియు పేనుల పునరుత్పత్తి మరియు ఆహార సేకరణను నిరోధించడం, చివరికి వాటి మరణానికి దారితీయడం25,26ఈ డేటా అనేక ప్రశ్నలను లేవనెత్తుతుంది. ఉదాహరణకు, Nan-Iav హెటెరోడైమర్ ఎలా ఏర్పడుతుంది, చిన్న అణువులను మాడ్యులేట్ చేయడానికి ఏ బైండింగ్ సైట్లు ఉపయోగించబడతాయి, మరియు ఈ చిన్న అణువులు ప్రొప్రియోసెప్షన్ను అణచివేయడం ద్వారా ఛానల్ పనితీరును ఎలా నియంత్రిస్తాయి అనే విషయాలు అస్పష్టంగానే ఉన్నాయి. అంతేకాకుండా, Nan స్వయంగా నిష్క్రియంగా ఉండి AP పట్ల తక్కువ అనుబంధాన్ని కలిగి ఉండగా, Nan-Iav హెటెరోడైమర్ క్రియాశీలంగా ఉండి APని అధిక అనుబంధంతో ఎందుకు బంధిస్తుంది అనే కారణాలు అస్పష్టంగానే ఉన్నాయి. చివరగా, Nan-Iav పనితీరు యొక్క Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ గురించి మరియు అది న్యూరోనల్ సిగ్నలింగ్ ప్రక్రియలలో ఎలా ఏకీకృతం చేయబడుతుంది అనే దాని గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.13,21
ఈ అధ్యయనంలో, క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ, ఎలక్ట్రోఫిజియాలజీ మరియు రేడియోలిగాండ్ బైండింగ్ టెక్నిక్లను కలపడం ద్వారా, మేము Nan-Iav యొక్క అసెంబ్లీని మరియు చిన్న అణువుల రెగ్యులేటర్లకు దాని బైండింగ్ విధానాన్ని విశదీకరించాము. అంతేకాకుండా, మేము Iav మరియు AP-స్థిరీకరించిన Nan పెంటామర్లకు నిరంతరం బంధించబడిన కాల్మోడ్యులిన్ (CaM)ను గుర్తించాము. ఈ ఫలితాలు ఛానెల్లలో కాల్షియం అయాన్ల నియంత్రణ, ఛానెల్ అసెంబ్లీ మరియు లిగాండ్ బైండింగ్ అఫినిటీని నిర్ణయించే కారకాలపై ముఖ్యమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి. మరింత ముఖ్యంగా, ఈ ప్రక్రియలలో ARD కేంద్ర పాత్ర పోషిస్తుందని మేము నిర్ధారించాము. సంబంధిత వ్యవసాయ పురుగుమందులకు బంధించబడిన పూర్తి కీటక ఛానెల్లపై మా అధ్యయనం27, 28, 29పురుగుమందుల పరిశ్రమ అభివృద్ధికి అవకాశాలను కల్పించడం, పురుగుమందుల సామర్థ్యాన్ని మరియు నిర్దిష్టతను మెరుగుపరచడం, అలాగే ప్రపంచ ఆహార భద్రతను మరియు వాహక-జనిత వ్యాధుల వ్యాప్తిని పరిష్కరించడానికి TRPV-లక్షిత సమ్మేళనాలను ఇతర జాతులకు వర్తింపజేయడానికి వీలు కల్పించడం.
Nan-Iav అనేది Ca2+ ద్వారా నియంత్రించబడుతుందని, మరియు ఈ నియంత్రణ విధానం నిరంతరం బంధించబడి ఉండే CaM ద్వారా జరుగుతుందని కూడా మేము కనుగొన్నాము. ముఖ్యంగా, CaM ద్వారా జరిగే Nav యొక్క ఈ Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ, ఇతర అయాన్ ఛానెళ్ల (ఉదాహరణకు, వోల్టేజ్-గేటెడ్ Na+ ఛానెళ్లు మరియు TRPV5/6 ఛానెళ్లు) నియంత్రణ విధానాల నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంటుంది.52,53,54,55,56,57Nav1.2 ఛానెల్లో, CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్, C-టెర్మినల్ డొమైన్ (CTD)తో హెలికల్గా అనుసంధానించబడి ఉంటుంది మరియు Ca2+ దాని N-టెర్మినల్ డొమైన్ను CTD యొక్క దూరపు భాగానికి బంధించేలా ప్రేరేపిస్తుంది.56TRPV5/6 ఛానెల్లో, CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ CTHకు బంధించబడుతుంది, మరియు Ca2+ దాని N-టెర్మినల్ డొమైన్ను రంధ్రంలోకి పైకి విస్తరించేలా ప్రేరేపిస్తుంది, తద్వారా కాటయాన్ పారగమ్యతను నిరోధిస్తుంది.53,54మేము Nan-Iav-CaM యొక్క Ca2+-నియంత్రిత విధి కొరకు ఒక నమూనాను ప్రతిపాదిస్తున్నాము (పటం 4h). ఈ నమూనాలో, CaM యొక్క N-టెర్మినల్ డొమైన్ నిరంతరం Iav యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ (CTH)కు బంధించబడి ఉంటుంది. విశ్రాంతి స్థితిలో (తక్కువ [Ca2+] గాఢత), CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ Nanతో సంకర్షణ చెంది, ARD ఆకృతిని స్థిరీకరించి, తద్వారా ఛానల్ తెరుచుకోవడాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది. ఒక అగోనిస్ట్/కీటకనాశిని ఛానల్కు బంధించడం వలన రంధ్రం తెరుచుకుంటుంది, ఇది Ca2+ ప్రవాహానికి దారితీస్తుంది. అప్పుడు Ca2+, CaMకు బంధించబడి, Nan యొక్క ARD నుండి C-టెర్మినల్ డొమైన్ విడిపోవడానికి కారణమవుతుంది. CaM బంధాన్ని నిరోధించడం వలన Ca2+ యొక్క నిరోధక ప్రభావం దాదాపుగా రద్దు అవుతుంది కాబట్టి, ఈ విడిపోవడం ARD చలనశీలతను మాడ్యులేట్ చేస్తుంది, తద్వారా Ca2+-ఆధారిత నిరోధం లేదా సున్నితత్వ క్షీణతకు కారణమవుతుంది. కాల్షియం అయాన్ ఎల్యూషన్ తర్వాత ఛానల్ కరెంట్లు వేగంగా పునరుద్ధరించబడటం (Fig. 4g), ఈ యంత్రాంగం Ca2+-మధ్యవర్తిత్వ నాడీ సంకేతాలకు వేగవంతమైన ప్రతిస్పందనలను సులభతరం చేస్తుందని సూచిస్తుంది. అంతేకాకుండా, Iav యొక్క C-టెర్మినల్ ప్రాంతం, దీని గురించి ఇంకా సరిగా అర్థం కాలేదు, ఛానల్ టార్గెటింగ్ మరియు కరెంట్ నియంత్రణలో ఇతర పాత్రలను పోషిస్తుందని నివేదించబడింది.21
చివరగా, మా అధ్యయనం వ్యవసాయ ప్రాముఖ్యత కలిగిన ఒక కీటకనాశిని-కీటకనాశిని TRP ఛానల్ కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణాన్ని అందిస్తోంది—ఇది ఇంతకు ముందు మాకు తెలియని ఒక ఆవిష్కరణ. ముఖ్యంగా, మేము కీటక కణాలలో కాకుండా మానవ కణాలలో (HEK293S GnTi–) కీటక ఛానల్ యొక్క నిర్మాణం మరియు పనితీరును వర్గీకరించాము. పెరుగుతున్న కీటకనాశిని నిరోధకత మరియు ఆహార భద్రత, వ్యాధికారకాలపై కొనసాగుతున్న ఒత్తిడి నేపథ్యంలో, మా పని మానవ ఆరోగ్యం మరియు ప్రపంచ ఆహార భద్రత ప్రయోజనం కోసం కొత్త కీటకనాశినుల అభివృద్ధిని సులభతరం చేసే ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. AP వంటి కీటకనాశినులు లేబుల్ సూచనల ప్రకారం ఉపయోగించినప్పుడు కొన్ని తెగుళ్లపై ప్రభావవంతంగా ఉంటాయని మరియు ప్రయోజనకరమైన పరాగసంపర్కాలకు తక్కువ తీవ్ర విషాన్ని కలిగి ఉంటాయని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది వాటి పర్యావరణ భద్రతను నిరూపిస్తుంది.13,16అంతేకాకుండా, దోమలపై కొన్ని AP ఉత్పన్నాలను పరీక్షించినప్పుడు, అవి చివరికి ఎగరగల సామర్థ్యాన్ని కోల్పోతాయని తేలింది. ఈ మాడ్యులేటింగ్ సమ్మేళనాలు Nan-Iavకు ఎలా బంధించబడతాయో అర్థం చేసుకోవడం వలన, మరింత ప్రభావవంతమైన మరియు కొత్త సమ్మేళనాలను అభివృద్ధి చేయడానికి ఇప్పటికే ఉన్న సమ్మేళనాలను సవరించడం సులభతరం అవుతుంది.ఖచ్చితమైనకీటక నియంత్రణ. అంతర్జనిత సమ్మేళనాలు, పురుగుమందులు మరియు Ca2+-CaM యొక్క కార్యాచరణను నియంత్రించడానికే కాకుండా, ఛానల్ నిర్మాణానికి కూడా Nan-Iav ARD ఇంటర్ఫేస్ కీలకమని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది. చిన్న అణువులతో హెటెరోడైమర్ నిర్మాణానికి అంతరాయం కలిగించడం అనేది అయాన్ ఛానల్ నిరోధకాలను అభివృద్ధి చేయడానికి ఒక ప్రత్యేకమైన మరియు ఆశాజనకమైన విధానం కావచ్చని మేము సూచిస్తున్నాము.
ఎనిమిది ఆర్థోలాగస్ జన్యువులలో, డిటర్జెంట్లలో అద్భుతమైన స్థిరత్వాన్ని ప్రదర్శించే బ్రౌన్ బీటిల్ (హాలియోమోర్ఫా హాలిస్) నాన్చుంగ్ మరియు ఇనాక్టివ్ యొక్క పూర్తి-నిడివి జన్యువులను ఎంపిక చేశారు. సంశ్లేషణ చేయబడిన జన్యువులను మానవ ఎక్స్ప్రెషన్ కోసం కోడాన్-ఆప్టిమైజ్ చేసి, XhoI మరియు EcoRI రెస్ట్రిక్షన్ సైట్లను ఉపయోగించి pBacMam pCMV-DEST వెక్టర్ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్) లోకి క్లోన్ చేశారు. దీనివల్ల, క్లోన్లు C-టెర్మినల్ GFP-FLAG-10xHis మరియు mCherry-FLAG-10xHis ట్యాగ్లతో ఫ్రేమ్లో ఉండేలా నిర్ధారించబడింది. ఈ ట్యాగ్లు HRC-3C ప్రొటీయేస్ (PPX) ద్వారా విచ్ఛిన్నం చేయబడతాయి, ఇది స్వతంత్ర ఎక్స్ప్రెషన్కు అనుమతిస్తుంది.వ్యక్తీకరణpBacMam వెక్టర్లోకి నాన్చుంగ్ మరియు ఇనాక్టివ్లను క్లోన్ చేయడానికి ఉపయోగించిన ప్రైమర్లు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి:
K3 కెమెరా మరియు గాటన్ బయోక్వాంటం ఎనర్జీ ఫిల్టర్తో కూడిన టైటాన్ క్రియోస్ G2 ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (FEI) ఉపయోగించి వ్యక్తిగత కణాల సూక్ష్మదర్శిని చిత్రాలను పొందారు. ఈ మైక్రోస్కోప్ను 300 keV వద్ద, 20 eV ఎనర్జీ సెట్టింగ్తో, 1.08 Å/పిక్సెల్ శాంపిల్ పిక్సెల్ సైజుతో (81,000x నామమాత్రపు మాగ్నిఫికేషన్), మరియు -0.8 నుండి -2.2 μm వరకు ఉండే డీఫోకస్ గ్రేడియంట్తో ఆపరేట్ చేశారు. 25 e–px−1 s−1 నామమాత్రపు డోస్ రేట్, 2.4 s ఎక్స్పోజర్ సమయం, మరియు సుమారుగా 60 e–Å−2 మొత్తం డోస్తో లాటిట్యూడ్ S మైక్రోస్కోప్ (గాటన్) ఉపయోగించి సెకనుకు 40 ఫ్రేమ్ల చొప్పున వీడియో రికార్డింగ్ చేశారు.
RELION 4.061 లోని MotionCor2 ను ఉపయోగించి ఫిల్మ్పై బీమ్-ప్రేరిత చలన సవరణ మరియు డోస్ వెయిటింగ్ చేయబడ్డాయి. క్రయోస్పార్క్లో ప్యాచ్-ఆధారిత CTF అంచనా పద్ధతి62 ను ఉపయోగించి కాంట్రాస్ట్ ట్రాన్స్ఫర్ ఫంక్షన్ (CTF) పారామీటర్ అంచనా వేయబడింది. CTF ఫిట్టింగ్ రిజల్యూషన్ ≥4 Å ఉన్న ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్లు తదుపరి విశ్లేషణ నుండి మినహాయించబడ్డాయి. సాధారణంగా, క్రయోస్పార్క్లో పాయింట్ ఎంపిక కోసం 500–1000 ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ల ఉపసమితిని ఉపయోగించారు, ఆ తర్వాత టెంప్లేట్-ఆధారిత పార్టికల్ ఎంపిక కోసం స్పష్టమైన రిఫరెన్స్ ఇమేజ్ను పొందడానికి ఫిల్టరింగ్ చేసి అనేక రౌండ్ల 2D వర్గీకరణ చేశారు. ఆ తర్వాత 64-పిక్సెల్ బౌండింగ్ బాక్స్లు మరియు 4-ఫోల్డ్ బిన్నింగ్ను ఉపయోగించి పార్టికల్స్ను సంగ్రహించారు. అనవసరమైన పార్టికల్ కేటగిరీలను తొలగించడానికి అనేక రౌండ్ల 2D వర్గీకరణ చేయబడింది. ప్రారంభ 3D మోడల్ను అబ్ ఇనిషియో రీకన్స్ట్రక్షన్ ఉపయోగించి పునర్నిర్మించారు మరియు క్రయోస్పార్క్లో నాన్యూనిఫామ్ రిఫైన్మెంట్ ఉపయోగించి శుద్ధి చేశారు. ARD భిన్నత్వం ఆధారంగా క్రయోస్పార్క్ లేదా RELION లో 3D వర్గీకరణ చేయబడింది. మెంబ్రేన్ డొమైన్లలో గణనీయమైన భిన్నత్వం ఏదీ గమనించబడలేదు. C1 మరియు C2 పద్ధతులను ఉపయోగించి కణాలను శుద్ధి చేశారు; అధిక C2 రిజల్యూషన్ ఉన్న కణాలను C2 పరంగా సౌష్టవంగా పరిగణించి, బయేసియన్ శుద్ధీకరణ కోసం RELION లోకి దిగుమతి చేసుకున్నారు. ఆ తర్వాత తుది అసమాన మరియు స్థానిక శుద్ధీకరణ కోసం కణాలను తిరిగి క్రయోస్పార్క్కు బదిలీ చేశారు. తుది రిజల్యూషన్ మరియు కణాల సంఖ్యలు పట్టిక 1లో చూపబడ్డాయి.
Nan+AP పెంటామర్లను ప్రాసెస్ చేస్తున్నప్పుడు, మెంబ్రేన్ డొమైన్ల (ముఖ్యంగా పోర్ ప్రాంతం) రిజల్యూషన్ను మెరుగుపరచడానికి, సిగ్నల్ సబ్ట్రాక్షన్ మరియు TMD మాస్కింగ్ వంటి వివిధ పద్ధతులను మేము అన్వేషించాము. అయితే, పోర్ ప్రాంతంలో ఉండే తీవ్రమైన క్రమరాహిత్యం మరియు TMD యొక్క మొత్తం భిన్నత్వం కారణంగా ఈ ప్రయత్నాలు విఫలమయ్యాయి. క్రయోస్పార్క్లోని నాన్యూనిఫామ్ ప్రాసెసింగ్ పద్ధతి ద్వారా స్వయంచాలకంగా రూపొందించబడిన మాస్క్ను ఉపయోగించి తుది రిజల్యూషన్ను లెక్కించాము, ఇది ప్రధానంగా ARD ప్రాంతాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకుంది. దీనివల్ల మెంబ్రేన్ డొమైన్ల (ముఖ్యంగా VSLD ప్రాంతం) రిజల్యూషన్ కంటే గణనీయంగా అధిక రిజల్యూషన్ సాధించబడింది.
నాన్చుంగ్ మరియు ఇనాక్టివ్ బగ్స్ యొక్క అపో రూపాల యొక్క ప్రారంభ డి నోవో నమూనాలను మొదట Coot63 ఉపయోగించి రూపొందించారు, మరియు తక్కువ విశ్వసనీయత గల ప్రాంతాలను గుర్తించడానికి నాన్ మరియు ఐయావ్ బగ్స్ యొక్క నమూనాలను AlphaFold264 ఉపయోగించి రూపొందించారు. కాల్మోడ్యులిన్ మోడలింగ్, వరుసగా PDB యాక్సెషన్లు 4JPZ56 మరియు 1CFD65లోని Ca2+-బైండింగ్ మరియు Ca2+-ఫ్రీ నమూనాల యొక్క రిజిడ్-బాడీ ఫిట్లపై ఆధారపడింది. సరైన స్టీరియోకెమిస్ట్రీ మరియు మంచి జ్యామితిని నిర్ధారించడానికి స్ఫెరికల్ రిఫైన్మెంట్ ఉపయోగించి నమూనాలను శుద్ధి చేశారు. ఆ తర్వాత ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్, ఫాస్ఫాటిడైల్ఇథనొలమైన్, మరియు ఫాస్ఫాటిడైల్సెరిన్లను సునిర్వచిత లిపిడ్ సాంద్రతలుగా మోడల్ చేశారు, మరియు NAM మరియు AP లిగాండ్లను టైట్ జంక్షన్లలోని సంబంధిత సాంద్రతలలో ఉంచారు. PHENIX66లోని eLBOW ఉపయోగించి ఐసోఫారమ్ల యొక్క SMILES స్ట్రింగ్ నుండి కన్స్ట్రెయింట్ ఫైల్లను రూపొందించారు. చివరగా, సెకండరీ స్ట్రక్చర్ పరిమితులతో లోకల్ గ్రిడ్ సెర్చ్ మరియు గ్లోబల్ మినిమైజేషన్ ఉపయోగించి ఫీనిక్స్ (PHENIX) లో రియల్ స్పేస్లో మోడల్స్ను మెరుగుపరిచారు. మోడల్ మెరుగుదల మరియు నిర్మాణ విశ్లేషణ కోసం మోల్ప్రోబిటీ (MolProbity) సర్వర్ను ఉపయోగించారు, మరియు పైమాల్ (PyMOL) మరియు యుసిఎస్ఎఫ్ చిమెరా ఎక్స్ (UCSF Chimera X) ఉపయోగించి చిత్రాలను రూపొందించారు. 67,68,69 హోల్ (HOLE) సర్వర్ను ఉపయోగించి అపెర్చర్ విశ్లేషణ,70 మరియు కాన్సర్ఫ్ (Consurf) సర్వర్ను ఉపయోగించి సీక్వెన్స్ కన్జర్వేషన్ మ్యాపింగ్ నిర్వహించబడింది.71
ఇగోర్ ప్రో 6.2, ఎక్సెల్ ఆఫీస్ 365, మరియు గ్రాఫ్ప్యాడ్ ప్రిజం 7.0 ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. అన్ని పరిమాణాత్మక డేటా సగటు ± ప్రామాణిక దోషం (SEM)గా ప్రదర్శించబడింది. రెండు సమూహాలను పోల్చడానికి స్టూడెంట్స్ t-పరీక్ష (రెండు-వైపుల, జతకాని) ఉపయోగించబడింది. బహుళ సమూహాలను పోల్చడానికి వన్-వే అనాలిసిస్ ఆఫ్ వేరియెన్స్ (ANOVA) మరియు దాని తర్వాత డన్నెట్ పోస్ట్ హాక్ పరీక్ష ఉపయోగించబడ్డాయి. *P< 0.05, **P< 0.01, మరియు ***Pడేటా పంపిణీని బట్టి < 0.001 విలువలను గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనవిగా పరిగణించారు. Kd, Ki విలువలు మరియు వాటి అసమరూప 95% విశ్వాస విరామాలను GraphPad Prism 10 ఉపయోగించి లెక్కించారు.
అధ్యయన పద్ధతికి సంబంధించిన మరిన్ని వివరాల కోసం, దయచేసి ఈ వ్యాసంలో లింక్ చేయబడిన నేచర్ పోర్ట్ఫోలియో నివేదిక సారాంశాన్ని చూడండి.
PDB 4JPZ మరియు 1CFD డేటాబేస్ల నుండి కాల్మోడ్యులిన్ నమూనాలను ఉపయోగించి ప్రారంభ నమూనా నిర్మించబడింది. కోఆర్డినేట్లు ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్ (PDB)లో 9NVN (లిగాండ్ లేని Nan-Iav-CaM), 9NVO (నికోటినమైడ్కు బంధించబడిన Nan-Iav-CaM), 9NVP (నికోటినమైడ్ మరియు EDTAకు బంధించబడిన Nan-Iav-CaM), 9NVQ (అఫెనిడాల్పైరోలిన్ మరియు కాల్షియంకు బంధించబడిన Nan-Iav-CaM), 9NVR (అఫెనిడాల్పైరోలిన్ మరియు EDTAకు బంధించబడిన Nan-Iav-CaM), మరియు 9NVS (అఫెనిడాల్పైరోలిన్కు బంధించబడిన Nan పెంటామర్) యాక్సెషన్ నంబర్ల క్రింద నిక్షిప్తం చేయబడ్డాయి. సంబంధిత క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ చిత్రాలు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ డేటాబేస్ (EMDB)లో ఈ క్రింది యాక్సెషన్ నంబర్ల క్రింద నిక్షిప్తం చేయబడ్డాయి: EMD-49844 (లిగాండ్ లేని Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (నికోటినమైడ్తో కూడిన Nan-Iav-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49846 (నికోటినమైడ్ మరియు EDTAతో కూడిన Nan-Iav-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49847 (ఆఫిడోపైరోలిన్ మరియు కాల్షియంతో కూడిన Nan-Iav-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49848 (ఆఫిడోపైరోలిన్ మరియు EDTAతో కూడిన Nan-Iav-CaM కాంప్లెక్స్), మరియు EMD-49849 (ఆఫిడోపైరోలిన్తో కూడిన Nan పెంటామర్ కాంప్లెక్స్). క్రియాత్మక విశ్లేషణ కోసం ముడి డేటా ఈ పత్రంలో సమర్పించబడింది.
పోస్ట్ చేసిన సమయం: జనవరి-28-2026
