ప్రపంచ ఆహార కొరతను పరిష్కరించడంలో మరియు వెక్టర్ ద్వారా సంక్రమించే మానవ వ్యాధులను ఎదుర్కోవడంలో పురుగుమందులు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి. అయితే, పురుగుమందుల నిరోధకత పెరుగుతున్న సమస్యకు ఉపయోగించని లక్ష్యాలను లక్ష్యంగా చేసుకునే కొత్త సమ్మేళనాలను కనుగొనడం అత్యవసరం. కీటకాల తాత్కాలిక గ్రాహక సంభావ్యత (TRPV) ఛానెల్లు - నాన్జోంగ్ (నాన్) మరియు నిష్క్రియాత్మక (Iav) - హెటెరోలాగస్ ఛానెల్లను (Nan-Iav) ఏర్పరుస్తాయి మరియు కీటకాలలో జియోట్రోపిజం, వినికిడి మరియు ప్రొప్రియోసెప్షన్కు మధ్యవర్తిత్వం వహించే మెకనోసెన్సరీ అవయవాలకు స్థానికీకరించబడతాయి. అఫిడోపైరోలిడోన్ (AP) వంటి కొన్ని పురుగుమందులు తెలియని విధానాల ద్వారా నాన్-Iav ను లక్ష్యంగా చేసుకుంటాయి. AP పియర్సింగ్-సకింగ్ కీటకాలకు (హెమిప్టెరాన్లు) వ్యతిరేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటుంది, తంతువుల పనితీరును అంతరాయం కలిగించడం ద్వారా దాణాను నివారిస్తుంది. AP నాన్తో మాత్రమే బంధించగలదు, కానీ నాన్-Iav మాత్రమే ఎండోజెనస్ నికోటినామైడ్ (NAM)తో సహా అగోనిస్ట్లతో సంకర్షణ చెందుతుంది, తద్వారా ఛానల్ కార్యాచరణను ప్రదర్శిస్తుంది. పురుగుమందు లక్ష్యంగా నాన్-Iav యొక్క సామర్థ్యం ఉన్నప్పటికీ, దాని ఛానల్ అసెంబ్లీ, రెగ్యులేటరీ బైండింగ్ సైట్లు మరియు Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు, ఇది మరింత పురుగుమందుల అభివృద్ధికి ఆటంకం కలిగిస్తుంది. ఈ అధ్యయనంలో, కాల్మోడ్యులిన్-లిగాండ్-రహిత స్థితిలో హెమిప్టెరా కీటకాలలో నాన్-ఇయావ్ నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడానికి క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించారు, అలాగే ఆంకిరిన్ రిపీట్ సైటోప్లాస్మిక్ డొమైన్ (ARD) సరిహద్దు వద్ద AP మరియు NAM లతో కూడా దీనిని ఉపయోగించారు. ఆశ్చర్యకరంగా, నాన్ ప్రోటీన్ స్వయంగా పెంటామర్ను ఏర్పరుస్తుందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది AP-మధ్యవర్తిత్వ ARD పరస్పర చర్యల ద్వారా స్థిరీకరించబడుతుంది. ఈ అధ్యయనం పురుగుమందులు మరియు అగోనిస్ట్లు మరియు నాన్-ఇయావ్ మధ్య పరమాణు పరస్పర చర్యలను వెల్లడిస్తుంది, ఛానల్ ఫంక్షన్ మరియు అసెంబ్లీలో ARD యొక్క ప్రాముఖ్యతను హైలైట్ చేస్తుంది మరియు Ca2+ నియంత్రణ యొక్క యంత్రాంగాన్ని అన్వేషిస్తుంది.
ప్రపంచ వ్యాప్తంగా వాతావరణ మార్పులు పెరుగుతున్న నేపథ్యంలో, క్షీణిస్తున్న ప్రపంచ ఆహార భద్రత 21వ శతాబ్దపు ప్రధాన సవాళ్లలో ఒకటి, ఇది సమాజంపై విపరీత పరిణామాలను కలిగి ఉంది.1,2, 1,2,ప్రపంచ ఆరోగ్య సంస్థ యొక్క ప్రపంచ ఆహార భద్రత మరియు పోషకాహార స్థితి 2023 (SOFI) నివేదిక అంచనా ప్రకారం ప్రపంచవ్యాప్తంగా దాదాపు 2.33 బిలియన్ల మంది ప్రజలు దీర్ఘకాలిక సమస్య అయిన మితమైన నుండి తీవ్రమైన ఆహార అభద్రతతో బాధపడుతున్నారు.3,4, उपालదురదృష్టవశాత్తు, తెగుళ్ళు మరియు వ్యాధికారకాల వల్ల ఏటా 20% నుండి 30% లేదా అంతకంటే ఎక్కువ పంట దిగుబడి కోల్పోతున్నట్లు అంచనా వేయబడింది మరియు గ్లోబల్ వార్మింగ్ తెగుళ్ల నిరోధకత మరియు పంట దుర్బలత్వాన్ని మరింత పెంచుతుందని భావిస్తున్నారు.4,5,6,7,8, अनिक, अनिक, अनिक, अनीతెగుళ్ల నుండి పంటలను రక్షించడానికి మరియు వాహకాల ద్వారా సంక్రమించే వ్యాధికారకాల వ్యాప్తిని తగ్గించడానికి మాత్రమే కాకుండా, డెంగ్యూ జ్వరం, మలేరియా మరియు చాగస్ వ్యాధి వంటి వాహకాల ద్వారా సంక్రమించే మానవ వ్యాధులను ఎదుర్కోవడానికి కూడా పురుగుమందుల అభివృద్ధి చాలా కీలకం, ఇవి పురుగుమందులకు పెరుగుతున్న నిరోధకతను కలిగి ఉన్నాయి.5,9,10,11,
న్యూరోటాక్సిక్ పురుగుమందుల యొక్క ప్రధాన లక్ష్యాలలో, హెటెరోటెట్రామెరిక్ TRPV ఛానల్ నాన్చుంగ్ (నాన్)-ఇనాక్టివ్ (Iav) గత దశాబ్దంలో మాత్రమే కనుగొనబడిన పురుగుమందుల లక్ష్యాల తరగతిని సూచిస్తుంది, వీటిలో ఇమిడాక్లోప్రిడ్ మరియు పైరాక్లోస్ట్రోబిన్ వంటి వాణిజ్యపరంగా లభించే పురుగుమందులు ఉన్నాయి.12,13,14,సెమిసింథటిక్ క్రిమిసంహారక అఫిడోపైరోలిఫెన్ (AP) అనేది ఇటీవల అభివృద్ధి చేయబడిన మరియు వాణిజ్యీకరించబడిన ఉత్పత్తి, దీని ప్రధాన భాగం క్రియాశీల క్రిమిసంహారక ఇన్స్కాలిస్®, ఇది APని సబ్నానోమోలార్ కార్యాచరణ స్థాయిలో బంధిస్తుంది.15AP పరాగ సంపర్కాలు, ప్రయోజనకరమైన కీటకాలు మరియు ఇతర లక్ష్యం కాని జీవులకు తక్కువ తీవ్రమైన విషపూరితతను ప్రదర్శిస్తుంది మరియు లేబుల్ సూచనల ప్రకారం ఉపయోగించినప్పుడు, ఇది ఇతర పురుగుమందులకు నిరోధక ఒత్తిడిని తగ్గిస్తుంది.16,17,18నాన్ మరియు ఇయావ్ కీటకాల జాతులలో విస్తృతంగా పంపిణీ చేయబడ్డాయి, యాంటెన్నా మరియు అవయవాల యొక్క కార్డల్ స్ట్రెచ్ రిసెప్టర్ న్యూరాన్లలో మాత్రమే సహ-వ్యక్తీకరించబడ్డాయి మరియు వినికిడి, గురుత్వాకర్షణ అవగాహన మరియు ప్రొప్రియోసెప్షన్కు కీలకం.13,16,19,20,21,22,AP, ఇమిడాక్లోప్రిడ్ మరియు పైరాక్లోస్ట్రోబిన్ ఒక ప్రత్యేకమైన యంత్రాంగం ద్వారా నాన్-ఇయావ్ కాంప్లెక్స్ను ప్రేరేపిస్తాయి, చివరికి ప్రొప్రియోసెప్టివ్ సిగ్నల్ ట్రాన్స్డక్షన్ను నిరోధిస్తాయి.13,16,23,అఫిడ్స్ మరియు తెల్లదోమలు వంటి కుట్లు పీల్చే కీటకాలలో (హెమిప్టెరాన్లు), ప్రొప్రియోసెప్షన్ కోల్పోవడం వల్ల వాటి తినే సామర్థ్యం దెబ్బతింటుంది, చివరికి మరణానికి దారితీస్తుంది.13,24 మైండ్ఆసక్తికరంగా, AP నాన్-ఇయావ్ కాంప్లెక్స్కు అధిక అనుబంధాన్ని మరియు నాన్కు మాత్రమే తక్కువ అనుబంధాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది. APని నాన్-ఇయావ్కు బంధించడం వల్ల విద్యుత్ ప్రవాహం ప్రేరేపిస్తుంది, కానీ నాన్కు మాత్రమే బంధించడం వల్ల ఛానల్ కార్యాచరణ ప్రేరేపించబడదు. ఐయావ్ స్వయంగా APకి అస్సలు బంధించదు.16దీని అర్థం నాన్ మరియు ఇయావ్ వేర్వేరు నాన్-ఇయావ్ ఛానల్ కాంప్లెక్స్లను ఏర్పరుస్తాయి (ఉదా., వేర్వేరు స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తులు లేదా ఒకే స్టోయికియోమెట్రిక్ నిష్పత్తిలో వేర్వేరు అమరికలతో) లేదా AP బహుళ సైట్లకు బంధించవచ్చు. ఇంకా, సహజ అగోనిస్ట్ నికోటినామైడ్ (NAM) డ్రోసోఫిలా నాన్-ఇయావ్తో మైక్రోమోలార్ అనుబంధంతో బంధిస్తుంది, ఇన్ విట్రోలో అఫిడ్స్ (AP) మాదిరిగానే ప్రభావాలను ప్రదర్శిస్తుంది.16,25మరియు పురుగుల పునరుత్పత్తి మరియు ఆహారం నిరోధం, చివరికి వాటి మరణానికి దారితీస్తుంది.25,26, 25,. ఈ డేటా అనేక ప్రశ్నలను లేవనెత్తుతుంది. ఉదాహరణకు, నాన్-ఇయావ్ హెటెరోడైమర్ ఎలా ఏర్పడుతుంది, చిన్న అణువులను మాడ్యులేట్ చేయడానికి ఏ బైండింగ్ సైట్లను ఉపయోగిస్తారు మరియు ఈ చిన్న అణువులు ప్రొప్రియోసెప్షన్ను అణచివేయడం ద్వారా ఛానల్ ఫంక్షన్ను ఎలా నియంత్రిస్తాయి అనేది అస్పష్టంగానే ఉంది. ఇంకా, నాన్ స్వయంగా నిష్క్రియంగా ఉండటానికి మరియు AP పట్ల తక్కువ అనుబంధాన్ని కలిగి ఉండటానికి కారణాలు, నాన్-ఇయావ్ హెటెరోడైమర్ చురుకుగా ఉండి APని అధిక అనుబంధంతో బంధించడానికి కారణాలు అస్పష్టంగానే ఉన్నాయి. చివరగా, నాన్-ఇయావ్ ఫంక్షన్ యొక్క Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ మరియు అది న్యూరోనల్ సిగ్నలింగ్ ప్రక్రియలలో ఎలా విలీనం చేయబడిందనే దాని గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 13,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 20, 21, 29, 21, 21, 21, 21, 22, 23, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 21, 299, 21, 21, 22, 23, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 21, 29, 21, 21, 22, 23, 21, 22, 23, 24, 27, 21, 29, 21, 21, 22, 23, 21,
ఈ అధ్యయనంలో, క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ, ఎలక్ట్రోఫిజియాలజీ మరియు రేడియోలిగాండ్ బైండింగ్ పద్ధతులను కలిపి, మేము నాన్-ఇయావ్ యొక్క అసెంబ్లీని మరియు చిన్న అణువుల నియంత్రకాలకు దాని బంధన విధానాన్ని విశదీకరించాము. ఇంకా, మేము Iav మరియు AP- స్థిరీకరించిన నాన్ పెంటామర్లకు రాజ్యాంగబద్ధంగా కట్టుబడి ఉన్న కాల్మోడ్యులిన్ (CaM) ను గుర్తించాము. ఈ ఫలితాలు ఛానెల్లలో కాల్షియం అయాన్ల నియంత్రణ, ఛానల్ అసెంబ్లీ మరియు లిగాండ్ బైండింగ్ అనుబంధాన్ని నిర్ణయించే కారకాలపై ముఖ్యమైన అంతర్దృష్టులను అందిస్తాయి. మరింత ముఖ్యంగా, ఈ ప్రక్రియలలో ARD కేంద్ర పాత్ర పోషిస్తుందని మేము నిర్ధారించాము. సంబంధిత వ్యవసాయ పురుగుమందులకు కట్టుబడి ఉన్న పూర్తి కీటకాల ఛానెల్లపై మా అధ్యయనం.27, 28, 29పురుగుమందుల పరిశ్రమ అభివృద్ధికి అవకాశాలను తెరుస్తుంది, పురుగుమందుల సామర్థ్యం మరియు విశిష్టతను మెరుగుపరుస్తుంది మరియు ప్రపంచ ఆహార భద్రత మరియు వెక్టర్ ద్వారా సంక్రమించే వ్యాధుల వ్యాప్తిని పరిష్కరించడానికి ఇతర జాతులకు TRPV-లక్ష్యంగా ఉన్న సమ్మేళనాలను వర్తింపజేయడానికి వీలు కల్పిస్తుంది.
నాన్-ఇయావ్ Ca2+ ద్వారా నియంత్రించబడుతుందని మరియు నియంత్రణ యంత్రాంగం రాజ్యాంగబద్ధంగా కట్టుబడి ఉన్న CaM ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించబడుతుందని కూడా మేము కనుగొన్నాము. ముఖ్యంగా, CaM ద్వారా Nav యొక్క ఈ Ca2+-ఆధారిత నియంత్రణ ఇతర అయాన్ ఛానెల్ల నియంత్రణ విధానాల నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా ఉంటుంది (ఉదా., వోల్టేజ్-గేటెడ్ Na+ ఛానెల్లు మరియు TRPV5/6 ఛానెల్లు)52,53,54,55,56,57,. Nav1.2 ఛానెల్లో, CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ C-టెర్మినల్ డొమైన్ (CTD)తో హెలికల్గా అనుబంధించబడుతుంది మరియు Ca2+ దాని N-టెర్మినల్ డొమైన్ను CTD యొక్క దూర భాగానికి బంధించడాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది.56. TRPV5/6 ఛానెల్లో, CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ CTHకి బంధిస్తుంది మరియు Ca2+ దాని N-టెర్మినల్ డొమైన్ను రంధ్రానికి పైకి విస్తరించడానికి ప్రేరేపిస్తుంది, తద్వారా కేషన్ పారగమ్యతను నిరోధిస్తుంది.53,54 తెలుగు. Nan-Iav-CaM యొక్క Ca2+-నియంత్రిత ఫంక్షన్ కోసం మేము ఒక నమూనాను ప్రతిపాదిస్తున్నాము (Fig. 4h). ఈ నమూనాలో, CaM యొక్క N-టెర్మినల్ డొమైన్ Iav యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ (CTH) కు రాజ్యాంగబద్ధంగా బంధిస్తుంది. విశ్రాంతి స్థితిలో (తక్కువ [Ca2+] గాఢత), CaM యొక్క C-టెర్మినల్ డొమైన్ Nan తో సంకర్షణ చెందుతుంది, ARD ఆకృతిని స్థిరీకరిస్తుంది మరియు తద్వారా ఛానల్ ఓపెనింగ్ను ప్రోత్సహిస్తుంది. ఛానెల్కు అగోనిస్ట్/క్రిమిసంహారక మందును బంధించడం వలన పోర్ ఓపెనింగ్ ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది Ca2+ ప్రవాహానికి దారితీస్తుంది. తరువాత Ca2+ CaM తో బంధిస్తుంది, దీని వలన నాన్ యొక్క ARD నుండి C-టెర్మినల్ డొమైన్ విచ్ఛేదనం చెందుతుంది. CaM బైండింగ్ను నిరోధించడం వలన Ca2+ యొక్క నిరోధక ప్రభావం తప్పనిసరిగా రద్దు చేయబడుతుంది కాబట్టి, ఈ విచ్ఛేదనం ARD చలనశీలతను మాడ్యులేట్ చేస్తుంది, తద్వారా Ca2+-ఆధారిత నిరోధం లేదా డీసెన్సిటైజేషన్కు కారణమవుతుంది. కాల్షియం అయాన్ ఎల్యూషన్ తర్వాత ఛానల్ ప్రవాహాల వేగవంతమైన పునరుద్ధరణ (Fig. 4g) ఈ యంత్రాంగం Ca2+-మధ్యవర్తిత్వ న్యూరానల్ సిగ్నల్లకు వేగవంతమైన ప్రతిస్పందనలను సులభతరం చేస్తుందని సూచిస్తుంది. ఇంకా, Iav యొక్క C-టెర్మినల్ ప్రాంతం, ఇంకా సరిగా అర్థం కాలేదు, ఛానల్ టార్గెటింగ్ మరియు ప్రస్తుత నియంత్రణలో ఇతర పాత్రలను పోషిస్తుందని నివేదించబడింది.21
చివరగా, మా అధ్యయనం వ్యవసాయ ప్రాముఖ్యత కలిగిన క్రిమిసంహారక-క్రిమిసంహారక TRP ఛానల్ కాంప్లెక్స్ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ నిర్మాణాన్ని అందిస్తుంది - ఇది గతంలో మనకు తెలియని ఆవిష్కరణ. ముఖ్యంగా, మేము కీటకాల కణాలలో కాకుండా మానవ కణాలలో (HEK293S GnTi–) కీటకాల ఛానల్ నిర్మాణం మరియు పనితీరును వర్గీకరించాము. పెరుగుతున్న క్రిమిసంహారక నిరోధకత మరియు ఆహార భద్రత మరియు వ్యాధికారకాలపై కొనసాగుతున్న ఒత్తిడి నేపథ్యంలో, మా పని మానవ ఆరోగ్యం మరియు ప్రపంచ ఆహార భద్రత ప్రయోజనం కోసం కొత్త పురుగుమందుల అభివృద్ధిని సులభతరం చేసే ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. లేబుల్ సూచనల ప్రకారం ఉపయోగించినప్పుడు AP వంటి పురుగుమందులు కొన్ని తెగుళ్ళకు వ్యతిరేకంగా ప్రభావవంతంగా ఉంటాయని మరియు ప్రయోజనకరమైన పరాగ సంపర్కాలకు తక్కువ తీవ్రమైన విషపూరితతను కలిగి ఉన్నాయని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇవి వాటి పర్యావరణ భద్రతను ప్రదర్శిస్తాయి.13,16 మెక్సికోఇంకా, కొన్ని AP ఉత్పన్నాలను దోమలపై పరీక్షించినప్పుడు అవి చివరికి ఎగిరే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోతాయని తేలింది. ఈ మాడ్యులేటింగ్ సమ్మేళనాలు నాన్-ఇయావ్తో ఎలా బంధిస్తాయో అర్థం చేసుకోవడం వలన ఇప్పటికే ఉన్న సమ్మేళనాల మార్పు లేదా మరింత ప్రభావవంతమైన మరియు కొత్త సమ్మేళనాల అభివృద్ధి సులభతరం అవుతుంది.ఖచ్చితమైనతెగులు నియంత్రణ. నాన్-ఇయావ్ ARD ఇంటర్ఫేస్ ఎండోజెనస్ సమ్మేళనాలు, పురుగుమందులు మరియు Ca2+-CaM యొక్క కార్యకలాపాలను నియంత్రించడానికి మాత్రమే కాకుండా, ఛానల్ అసెంబ్లీకి కూడా కీలకమని మా అధ్యయనం నిరూపిస్తుంది. చిన్న అణువులతో హెటెరోడైమర్ అసెంబ్లీని అంతరాయం కలిగించడం అయాన్ ఛానల్ ఇన్హిబిటర్లను అభివృద్ధి చేయడానికి ఒక ప్రత్యేకమైన మరియు ఆశాజనకమైన విధానం కావచ్చని మేము సూచిస్తున్నాము.
ఎనిమిది ఆర్థోలాజస్ జన్యువులలో, బ్రౌన్ బీటిల్ (హాలియోమోర్ఫా హాలీస్) నాన్చుంగ్ మరియు ఇన్యాక్టివ్ యొక్క పూర్తి-నిడివి గల జన్యువులను ఎంపిక చేశారు, ఇవి డిటర్జెంట్లలో అద్భుతమైన స్థిరత్వాన్ని ప్రదర్శిస్తాయి. సంశ్లేషణ చేయబడిన జన్యువులను మానవ వ్యక్తీకరణ కోసం కోడాన్-ఆప్టిమైజ్ చేయబడ్డాయి మరియు XhoI మరియు EcoRI పరిమితి సైట్లను ఉపయోగించి pBacMam pCMV-DEST వెక్టర్ (లైఫ్ టెక్నాలజీస్)లోకి క్లోన్ చేయబడ్డాయి. ఇది క్లోన్లు C-టెర్మినల్ GFP-FLAG-10xHis మరియు mCherry-FLAG-10xHis ట్యాగ్లతో ఫ్రేమ్లో ఉన్నాయని నిర్ధారిస్తుంది, ఇవి HRC-3C ప్రోటీజ్ (PPX) ద్వారా క్లీవ్ చేయబడతాయి, స్వతంత్రంగా ఉండటానికి వీలు కల్పిస్తాయి.వ్యక్తీకరణ. నాన్చుంగ్ మరియు ఇన్యాక్టివ్లను pBacMam వెక్టర్లోకి క్లోన్ చేయడానికి ఉపయోగించిన ప్రైమర్లు ఈ క్రింది విధంగా ఉన్నాయి:
K3 కెమెరా మరియు గటాన్ బయోక్వాంటమ్ ఎనర్జీ ఫిల్టర్తో కూడిన టైటాన్ క్రియోస్ G2 ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్ (FEI) పై వ్యక్తిగత కణాల మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రాలు పొందబడ్డాయి. ఈ మైక్రోస్కోప్ 300 keV వద్ద, 20 eV శక్తి సెట్టింగ్, 1.08 Å/పిక్సెల్ నమూనా పిక్సెల్ పరిమాణం (81,000x నామమాత్రపు మాగ్నిఫికేషన్) మరియు -0.8 నుండి -2.2 μm వరకు డీఫోకస్ గ్రేడియంట్తో నిర్వహించబడింది. 25 e–px−1 s−1 నామమాత్రపు మోతాదు రేటు, 2.4 సెకన్ల ఎక్స్పోజర్ సమయం మరియు మొత్తం మోతాదు సుమారు 60 e–Å−2 తో లాటిట్యూడ్ S మైక్రోస్కోప్ (గటాన్) ఉపయోగించి సెకనుకు 40 ఫ్రేమ్ల వద్ద వీడియో రికార్డింగ్ నిర్వహించబడింది.
RELION 4.061 లో MotionCor2 ఉపయోగించి ఫిల్మ్పై బీమ్-ప్రేరిత మోషన్ కరెక్షన్ మరియు డోస్ వెయిటింగ్ జరిగాయి. ప్యాచ్-ఆధారిత CTF అంచనా పద్ధతి62 ఉపయోగించి క్రయోస్పార్క్లో కాంట్రాస్ట్ ట్రాన్స్ఫర్ ఫంక్షన్ (CTF) పారామితి అంచనా వేయబడింది. CTF ఫిట్టింగ్ రిజల్యూషన్ ≥4 Å ఉన్న ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్లు తదుపరి విశ్లేషణ నుండి మినహాయించబడ్డాయి. సాధారణంగా, క్రయోస్పార్క్లో పాయింట్ ఎంపిక కోసం 500–1000 ఫోటోమైక్రోగ్రాఫ్ల ఉపసమితిని ఉపయోగించారు, తరువాత టెంప్లేట్-ఆధారిత కణ ఎంపిక కోసం స్పష్టమైన రిఫరెన్స్ ఇమేజ్ను పొందడానికి ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత 2D వర్గీకరణ యొక్క అనేక రౌండ్లు జరిగాయి. 64-పిక్సెల్ బౌండింగ్ బాక్స్లు మరియు 4-ఫోల్డ్ బిన్నింగ్ ఉపయోగించి కణాలను సంగ్రహించారు. అవాంఛిత కణ వర్గాలను తొలగించడానికి 2D వర్గీకరణ యొక్క అనేక రౌండ్లు జరిగాయి. ప్రారంభ 3D మోడల్ను అబ్ ఇనిషియో పునర్నిర్మాణం ఉపయోగించి పునర్నిర్మించారు మరియు క్రయోస్పార్క్లో ఏకరీతి శుద్ధీకరణను ఉపయోగించి శుద్ధి చేశారు. ARD వైవిధ్యత ఆధారంగా క్రయోస్పార్క్ లేదా RELIONలో 3D వర్గీకరణ జరిగింది. పొర డొమైన్ల యొక్క గణనీయమైన వైవిధ్యత గమనించబడలేదు. C1 మరియు C2 పద్ధతులను ఉపయోగించి కణాలను శుద్ధి చేశారు; అధిక C2 రిజల్యూషన్ ఉన్న కణాలను C2కి సంబంధించి సుష్టంగా పరిగణించారు మరియు బయేసియన్ శుద్ధీకరణ కోసం RELIONలోకి దిగుమతి చేసుకున్నారు. ఆ తరువాత కణాలను తుది నాన్యూనిఫాం మరియు స్థానిక శుద్ధీకరణ కోసం క్రయోస్పార్క్కి తిరిగి బదిలీ చేశారు. తుది రిజల్యూషన్ మరియు కణ గణనలు టేబుల్ 1లో చూపబడ్డాయి.
Nan+AP పెంటామర్లను ప్రాసెస్ చేస్తున్నప్పుడు, మెమ్బ్రేన్ డొమైన్ల (ముఖ్యంగా పోర్ ప్రాంతం) రిజల్యూషన్ను మెరుగుపరచడానికి సిగ్నల్ తీసివేత మరియు TMD మాస్కింగ్ వంటి వివిధ పద్ధతులను మేము అన్వేషించాము. అయితే, పోర్ ప్రాంతంలో సంభావ్యంగా తీవ్రమైన రుగ్మత మరియు TMD యొక్క మొత్తం వైవిధ్యత కారణంగా ఈ ప్రయత్నాలు విఫలమయ్యాయి. క్రయోస్పార్క్లో నాన్యూనిఫాం ప్రాసెసింగ్ పద్ధతి ద్వారా స్వయంచాలకంగా ఉత్పత్తి చేయబడిన మాస్క్ను ఉపయోగించి తుది రిజల్యూషన్ లెక్కించబడింది, ప్రధానంగా ARD ప్రాంతాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకుంది. ఇది మెమ్బ్రేన్ డొమైన్ల (ముఖ్యంగా VSLD ప్రాంతం) కంటే గణనీయంగా ఎక్కువ రిజల్యూషన్ను సాధించింది.
నాన్చుంగ్ మరియు ఇన్యాక్టివ్ బగ్ల యొక్క అపో రూపాల యొక్క ప్రారంభ డి నోవో నమూనాలు మొదట కూట్63ని ఉపయోగించి ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి మరియు నాన్ మరియు ఇయావ్ బగ్ల నమూనాలు తక్కువ-విశ్వాస ప్రాంతాలను గుర్తించడానికి ఆల్ఫాఫోల్డ్264ని ఉపయోగించి ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి. కాల్మోడ్యులిన్ మోడలింగ్ వరుసగా PDB యాక్సెషన్లు 4JPZ56 మరియు 1CFD65లలో Ca2+-బైండింగ్ మరియు Ca2+-రహిత నమూనాల దృఢమైన-శరీర అమరికలపై ఆధారపడింది. సరైన స్టీరియోకెమిస్ట్రీ మరియు మంచి జ్యామితిని నిర్ధారించడానికి గోళాకార శుద్ధీకరణను ఉపయోగించి నమూనాలు శుద్ధి చేయబడ్డాయి. ఫాస్ఫాటిడైల్కోలిన్, ఫాస్ఫాటిడైలేథనోలమైన్ మరియు ఫాస్ఫాటిడైల్సెరిన్లను బాగా నిర్వచించబడిన లిపిడ్ సాంద్రతలుగా రూపొందించారు మరియు NAM మరియు AP లిగాండ్లను టైట్ జంక్షన్లలో సంబంధిత సాంద్రతలలో ఉంచారు. PHENIX66లోని eLBOWని ఉపయోగించి ఐసోఫామ్ల యొక్క SMILES స్ట్రింగ్ నుండి నిర్బంధ ఫైళ్లు రూపొందించబడ్డాయి. చివరగా, ద్వితీయ నిర్మాణ పరిమితులతో స్థానిక గ్రిడ్ శోధన మరియు గ్లోబల్ కనిష్టీకరణను ఉపయోగించి నమూనాలు PHENIXలోని వాస్తవ స్థలంలో శుద్ధి చేయబడ్డాయి. మోల్ప్రోబిటీ సర్వర్ మోడల్ రిఫైన్మెంట్ మరియు స్ట్రక్చరల్ విశ్లేషణ కోసం ఉపయోగించబడింది మరియు PyMOL మరియు UCSF చిమెరా X ఉపయోగించి దృష్టాంతాలు ప్రదర్శించబడ్డాయి. 67,68,69 HOLE సర్వర్ ఉపయోగించి ఎపర్చరు విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది,70 మరియు కన్సర్ఫ్ సర్వర్ ఉపయోగించి సీక్వెన్స్ కన్జర్వేషన్ మ్యాపింగ్ నిర్వహించబడింది.71
ఇగోర్ ప్రో 6.2, ఎక్సెల్ ఆఫీస్ 365 మరియు గ్రాప్ప్యాడ్ ప్రిజం 7.0 లను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ జరిగింది. అన్ని పరిమాణాత్మక డేటాను సగటు ± ప్రామాణిక లోపం (SEM) గా ప్రదర్శించారు. రెండు సమూహాలను పోల్చడానికి విద్యార్థి యొక్క t-పరీక్ష (రెండు-తోక, జత చేయనిది) ఉపయోగించబడింది. బహుళ సమూహాలను పోల్చడానికి డన్నెట్ యొక్క పోస్ట్ హాక్ పరీక్ష తర్వాత వన్-వే విశ్లేషణ ఆఫ్ వేరియెన్స్ (ANOVA) ఉపయోగించబడింది. *P< 0.05, ** పి< 0.01, మరియు ***Pడేటా పంపిణీని బట్టి < 0.001 గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా పరిగణించబడ్డాయి. Kd, Ki విలువలు మరియు వాటి అసమాన 95% విశ్వాస విరామాలు గ్రాఫ్ప్యాడ్ ప్రిజం 10 ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి.
అధ్యయన పద్దతి గురించి మరిన్ని వివరాల కోసం, దయచేసి ఈ వ్యాసంలో లింక్ చేయబడిన నేచర్ పోర్ట్ఫోలియో నివేదిక సారాంశాన్ని చూడండి.
ప్రారంభ నమూనా PDB 4JPZ మరియు 1CFD డేటాబేస్ల నుండి కాల్మోడ్యులిన్ నమూనాలను ఉపయోగించి నిర్మించబడింది. కోఆర్డినేట్లను ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్ (PDB)లో యాక్సెషన్ సంఖ్యలు 9NVN (లిగాండ్ లేకుండా నాన్-ఐయావ్-CaM), 9NVO (నికోటినామైడ్కి నాన్-ఐయావ్-CaM కట్టుబడి ఉంటుంది), 9NVP (నికోటినామైడ్ మరియు EDTAకి నాన్-ఐయావ్-CaM కట్టుబడి ఉంటుంది), 9NVQ (అఫెనిడోల్పైర్రోలిన్ మరియు కాల్షియంకు నాన్-ఐయావ్-CaM కట్టుబడి ఉంటుంది), 9NVR (అఫెనిడోల్పైర్రోలిన్ మరియు EDTAకి నాన్-ఐయావ్-CaM కట్టుబడి ఉంటుంది) మరియు 9NVS (అఫెనిడోల్పైర్రోలిన్కు నాన్ పెంటామర్ కట్టుబడి ఉంటుంది) కింద నిక్షిప్తం చేశారు. సంబంధిత క్రయో-ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ చిత్రాలు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ డేటాబేస్ (EMDB)లో ఈ క్రింది యాక్సెషన్ సంఖ్యల క్రింద నిక్షిప్తం చేయబడ్డాయి: EMD-49844 (లిగాండ్ లేకుండా నాన్-ఇయావ్-CaM), EMD-49845 (నికోటినామైడ్తో నాన్-ఇయావ్-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49846 (నికోటినామైడ్ మరియు EDTAతో నాన్-ఇయావ్-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49847 (అఫిడోపైరోలిన్ మరియు కాల్షియంతో నాన్-ఇయావ్-CaM కాంప్లెక్స్), EMD-49848 (అఫిడోపైరోలిన్ మరియు EDTAతో నాన్-ఇయావ్-CaM కాంప్లెక్స్), మరియు EMD-49849 (అఫిడోపైరోలిన్తో నాన్ పెంటామర్ కాంప్లెక్స్). క్రియాత్మక విశ్లేషణ కోసం ముడి డేటా ఈ పత్రంలో ప్రదర్శించబడింది.
పోస్ట్ సమయం: జనవరి-28-2026