నులిపురుగుల నివారణ మందు N,N-డైఇథైల్-m-టోలుమైడ్ (డీట్ఇది AChE (ఎసిటైల్కోలినెస్టరేస్)ను నిరోధిస్తుందని మరియు అధిక రక్తనాళీకరణ కారణంగా క్యాన్సర్ కారక లక్షణాలను కలిగి ఉంటుందని నివేదించబడింది. ఈ పత్రంలో, DEET ప్రత్యేకంగా ఆంజియోజెనిసిస్ను ప్రోత్సహించే ఎండోథెలియల్ కణాలను ప్రేరేపిస్తుందని, తద్వారా కణితి పెరుగుదలను పెంచుతుందని మేము చూపిస్తున్నాము. DEET, కణాల విస్తరణ, వలస మరియు అతుక్కోవడం వంటి ఆంజియోజెనిసిస్కు దారితీసే కణ ప్రక్రియలను ఉత్తేజపరుస్తుంది. ఇది ఎండోథెలియల్ కణాలలో పెరిగిన NO ఉత్పత్తి మరియు VEGF వ్యక్తీకరణతో ముడిపడి ఉంటుంది. M3ను నిశ్శబ్దం చేయడం లేదా ఫార్మకోలాజికల్ M3 నిరోధకాలను ఉపయోగించడం ఈ ప్రభావాలన్నింటినీ రద్దు చేసింది, ఇది DEET-ప్రేరిత ఆంజియోజెనిసిస్ M3-సెన్సిటివ్ అని సూచిస్తుంది. M3 గ్రాహకాలను అధికంగా వ్యక్తీకరించే ఎండోథెలియల్ మరియు HEK కణాలలో కాల్షియం సిగ్నలింగ్తో కూడిన ప్రయోగాలు, అలాగే బైండింగ్ మరియు డాకింగ్ అధ్యయనాలు, DEET M3 గ్రాహకాల యొక్క అల్లోస్టెరిక్ మాడ్యులేటర్గా పనిచేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. అంతేకాకుండా, DEET AChEను నిరోధిస్తుంది, తద్వారా ఎసిటైల్కోలిన్ యొక్క జీవ లభ్యతను మరియు M3 గ్రాహకాలకు దాని బైండింగ్ను పెంచుతుంది, మరియు అల్లోస్టెరిక్ నియంత్రణ ద్వారా ప్రోఆంజియోజెనిక్ ప్రభావాలను మెరుగుపరుస్తుంది.
స్విస్ ఎలుకల బృహద్ధమని నుండి ప్రాథమిక ECలను వేరు చేశారు. సంగ్రహణ పద్ధతిని కోబయాషి ప్రోటోకాల్ 26 నుండి స్వీకరించారు. మ్యూరిన్ ECలను 5% హీట్-ఇనాక్టివేటెడ్ FBSతో అనుబంధంగా ఉన్న EBM-2 మాధ్యమంలో నాల్గవ పాసేజ్ వరకు కల్చర్ చేశారు.
CyQUANT సెల్ ప్రొలిఫరేషన్ అస్సే కిట్ (మాలిక్యులర్ ప్రోబ్స్, C7026) ఉపయోగించి HUVEC, U87MG, లేదా BF16F10 కణాల వృద్ధిపై DEET యొక్క రెండు గాఢతల ప్రభావాన్ని విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, ఒక 96-వెల్ ప్లేట్లో ఒక్కో వెల్కు 5.103 కణాలను వేసి, రాత్రంతా అతుక్కుపోవడానికి అనుమతించి, ఆపై 24 గంటల పాటు DEETతో ట్రీట్ చేశారు. గ్రోత్ మీడియంను తొలగించిన తర్వాత, మైక్రోప్లేట్లోని ప్రతి వెల్కు డై బైండింగ్ సొల్యూషన్ను జోడించి, కణాలను 37 °C వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 485 nm ఎక్సైటేషన్ ఫిల్టర్లు మరియు 530 nm ఎమిషన్ ఫిల్టర్లతో కూడిన మిథ్రాస్ LB940 మల్టీమోడ్ మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (బెర్తోల్డ్ టెక్నాలజీస్, బాడ్ వైల్డ్బాడ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ స్థాయిలను నిర్ధారించారు.
HUVEC కణాలను 96-వెల్ ప్లేట్లలో ఒక్కో వెల్కు 104 కణాల సాంద్రతతో విత్తారు. కణాలకు 24 గంటల పాటు DEET తో చికిత్స చేశారు. కలరిమెట్రిక్ MTT అస్సే (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, M5655) ఉపయోగించి కణాల జీవసామర్థ్యాన్ని అంచనా వేశారు. 570 nm తరంగదైర్ఘ్యం వద్ద మల్టీమోడ్ మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (మిథ్రాస్ LB940) పై ఆప్టికల్ డెన్సిటీ విలువలను పొందారు.
ఇన్ విట్రో యాంజియోజెనిసిస్ అస్సేలను ఉపయోగించి DEET యొక్క ప్రభావాలను అధ్యయనం చేశారు. 10-8 M లేదా 10-5 M DEET తో చికిత్స చేయడం వల్ల HUVEC లలో కేశనాళిక పొడవు ఏర్పడటం పెరిగింది (పటం 1a, b, తెల్లని బార్లు). నియంత్రణ సమూహంతో పోల్చినప్పుడు, 10-14 నుండి 10-5 M వరకు ఉన్న DEET గాఢతలతో చికిత్స చేసినప్పుడు, 10-8 M DEET వద్ద కేశనాళిక పొడవు ఒక పీఠభూమిని చేరుకుందని తేలింది (అనుబంధ పటం S2). 10-8 M మరియు 10-5 M గాఢత పరిధిలో DEET తో చికిత్స పొందిన HUVEC ల యొక్క ఇన్ విట్రో ప్రోయాంజియోజెనిక్ ప్రభావంలో ఎటువంటి గణనీయమైన తేడా కనుగొనబడలేదు.
నియోవాస్కులరైజేషన్పై DEET ప్రభావాన్ని నిర్ధారించడానికి, మేము ఇన్ వివో నియోవాస్కులరైజేషన్ అధ్యయనాలను నిర్వహించాము. 14 రోజుల తర్వాత, 10-8 M లేదా 10-5 M DEETతో ముందుగా కల్చర్ చేయబడిన ఎండోథెలియల్ కణాలను ఇంజెక్ట్ చేసిన ఎలుకలలో హిమోగ్లోబిన్ పరిమాణంలో గణనీయమైన పెరుగుదల కనిపించింది (Fig. 1c, తెల్లని బార్లు).
ఇంకా, బహిర్గతమైన మానవులలో సాధారణమైన 10-5 M ప్లాస్మా సాంద్రతలను ప్రేరేపించే మోతాదులో DEETను ప్రతిరోజూ (ip) ఇంజెక్ట్ చేసిన U87MG జెనోగ్రాఫ్ట్-ధరించే ఎలుకలలో DEET-ప్రేరిత నియోవాస్కులరైజేషన్ను అధ్యయనం చేశారు. ఎలుకలలోకి U87MG కణాలను ఇంజెక్ట్ చేసిన 14 రోజుల తర్వాత గుర్తించదగిన కణితులు (అంటే కణితులు >100 mm3) గమనించబడ్డాయి. 28వ రోజున, నియంత్రణ ఎలుకలతో పోలిస్తే DEET-చికిత్స పొందిన ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల గణనీయంగా మెరుగుపడింది (Fig. 1d, చతురస్రాలు). ఇంకా, కణితుల CD31 స్టెయినింగ్, DEET కేశనాళికల వైశాల్యాన్ని గణనీయంగా పెంచిందని, కానీ సూక్ష్మ రక్తనాళాల సాంద్రతను పెంచలేదని చూపించింది (Fig. 1e–g).
DETA- ప్రేరిత కణ విభజనలో మస్కారినిక్ గ్రాహకాల పాత్రను నిర్ధారించడానికి, pFHHSiD (10-7 M, ఒక సెలెక్టివ్ M3 గ్రాహక విరోధి) సమక్షంలో 10-8 M లేదా 10-5 M DETA ను ఉపయోగించారు. HUVEC తో చికిత్స. pFHHSiD అన్ని గాఢతలలో DETA యొక్క కణ విభజన లక్షణాలను పూర్తిగా నిరోధించింది (పట్టిక 1).
ఈ పరిస్థితులలో, HUVEC కణాలలో DEET కేశనాళిక పొడవును పెంచుతుందో లేదో కూడా మేము పరిశీలించాము. అదేవిధంగా, pFHHSiD, DEET ప్రేరిత కేశనాళిక పొడవును గణనీయంగా నిరోధించింది (పటం 1a, b, బూడిద రంగు బార్లు). అంతేకాకుండా, M3 siRNAతో కూడా ఇలాంటి ప్రయోగాలు నిర్వహించబడ్డాయి. నియంత్రణ siRNA కేశనాళికల ఏర్పాటును ప్రోత్సహించడంలో ప్రభావవంతంగా లేనప్పటికీ, M3 మస్కారినిక్ గ్రాహకాన్ని నిశ్శబ్దం చేయడం వలన కేశనాళిక పొడవును పెంచే DEET సామర్థ్యం రద్దు చేయబడింది (పటం 1a, b, నలుపు రంగు బార్లు).
ఇంకా, ఇన్ విట్రోలో 10-8 M లేదా 10-5 M DEET-ప్రేరిత వాస్కులరైజేషన్ మరియు ఇన్ వివోలో నియోవాస్కులరైజేషన్ రెండూ pFHHSiD ద్వారా పూర్తిగా నిరోధించబడ్డాయి (Fig. 1c, d, వృత్తాలు). ఈ ఫలితాలు DEET, సెలెక్టివ్ M3 రిసెప్టర్ యాంటాగోనిస్ట్లు లేదా M3 siRNA లకు సున్నితమైన మార్గం ద్వారా యాంజియోజెనిసిస్ను ప్రోత్సహిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
AChE అనేది DEET యొక్క అణు లక్ష్యం. AChE నిరోధకాలుగా పనిచేసే డోనెపెజిల్ వంటి మందులు, ఇన్ విట్రోలో మరియు మౌస్ హిండ్లింబ్ ఇస్కీమియా నమూనాలలో EC యాంజియోజెనిసిస్ను ప్రేరేపించగలవు¹⁴. మేము HUVECలో AChE ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలపై DEET యొక్క రెండు సాంద్రతల ప్రభావాన్ని పరీక్షించాము. నియంత్రణ పరిస్థితులతో పోలిస్తే DEET యొక్క తక్కువ (10⁻⁸ M) మరియు అధిక (10⁻⁵ M) సాంద్రతలు ఎండోథెలియల్ AChE కార్యకలాపాలను తగ్గించాయి (Fig. 2).
DEET యొక్క రెండు గాఢతలు (10-8 M మరియు 10-5 M) HUVEC పై ఎసిటైల్కోలినెస్టరేస్ చర్యను తగ్గించాయి. ఎసిటైల్కోలినెస్టరేస్ నిరోధకాలకు నియంత్రణగా BW284c51 (10-5 M) ఉపయోగించబడింది. ఫలితాలు, వాహనంతో చికిత్స పొందిన కణాలతో పోలిస్తే, DEET యొక్క రెండు గాఢతలతో చికిత్స పొందిన HUVEC పై AChE చర్య యొక్క శాతంగా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. విలువలు ఆరు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు ± SEM గా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. *నియంత్రణతో పోలిస్తే p < 0.05 (క్రుస్కల్-వాలిస్ మరియు డన్ బహుళ పోలిక పరీక్ష).
నైట్రిక్ ఆక్సైడ్ (NO) ఆంజియోజెనిక్ ప్రక్రియలో పాల్గొంటుంది 33, అందువల్ల, DEET-ఉత్తేజిత HUVECలలో NO ఉత్పత్తిని అధ్యయనం చేశారు. నియంత్రణ కణాలతో పోలిస్తే DEET-చికిత్స పొందిన ఎండోథెలియల్ NO ఉత్పత్తి పెరిగింది, కానీ 10-8 M మోతాదులో మాత్రమే గణనీయమైన స్థాయికి చేరుకుంది (Fig. 3c). DEET-ప్రేరిత NO ఉత్పత్తిని నియంత్రించే అణు మార్పులను నిర్ధారించడానికి, eNOS వ్యక్తీకరణ మరియు క్రియాశీలతను వెస్టర్న్ బ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు. DEET చికిత్స eNOS వ్యక్తీకరణను మార్చనప్పటికీ, చికిత్స పొందని కణాలతో పోలిస్తే eNOS ఫాస్ఫోరైలేషన్లో, ఇది దాని క్రియాశీలక స్థానం (Ser-1177) వద్ద eNOS ఫాస్ఫోరైలేషన్ను గణనీయంగా పెంచింది, అదే సమయంలో దాని నిరోధక స్థానం (Thr-495) వద్ద తగ్గించింది (Fig. 3d). ఇంకా, ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ eNOS మొత్తాన్ని మొత్తం ఎంజైమ్ మొత్తానికి సాధారణీకరించిన తర్వాత, క్రియాశీలక స్థానం మరియు నిరోధక స్థానం వద్ద ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ eNOS నిష్పత్తిని లెక్కించారు. చికిత్స పొందని కణాలతో పోలిస్తే DEET యొక్క ప్రతి గాఢతతో చికిత్స పొందిన HUVECలలో ఈ నిష్పత్తి గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 3d).
చివరగా, ప్రధాన ప్రోయాంజియోజెనిక్ కారకాలలో ఒకటైన VEGF యొక్క వ్యక్తీకరణను వెస్టర్న్ బ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు. DEET VEGF వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా పెంచింది, అయితే pFHHSiD ఈ వ్యక్తీకరణను పూర్తిగా నిరోధించింది.
DEET యొక్క ప్రభావాలు ఫార్మకోలాజికల్ బ్లాకేడ్ మరియు M3 రిసెప్టర్ల డౌన్రెగ్యులేషన్ రెండింటికీ సున్నితంగా ఉంటాయి కాబట్టి, DEET కాల్షియం సిగ్నలింగ్ను పెంచుతుందనే పరికల్పనను మేము పరీక్షించాము. ఆశ్చర్యకరంగా, ఉపయోగించిన రెండు గాఢతలలోనూ DEET, HUVEC (డేటా చూపబడలేదు) మరియు HEK/M3 (Fig. 4a, b) లలో సైటోప్లాస్మిక్ కాల్షియంను పెంచడంలో విఫలమైంది.
పోస్ట్ సమయం: డిసెంబర్-30-2024
