ఎండోథెలియల్ కణాలలో మస్కారినిక్ M3 గ్రాహకాల యొక్క అలోస్టెరిక్ మాడ్యులేషన్ ద్వారా యాంజియోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది.

  
క్రిమినాశక మందు N,N-డైథైల్-m-టోలుఅమైడ్ (డీట్) ACHE (ఎసిటైల్‌కోలినెస్టెరేస్) ని నిరోధించగలదని మరియు అధిక వాస్కులరైజేషన్ కారణంగా సంభావ్య క్యాన్సర్ కారక లక్షణాలను కలిగి ఉందని నివేదించబడింది. ఈ పత్రంలో, DEET ప్రత్యేకంగా యాంజియోజెనిసిస్‌ను ప్రోత్సహించే ఎండోథెలియల్ కణాలను ప్రేరేపిస్తుందని, తద్వారా కణితి పెరుగుదలను పెంచుతుందని మేము చూపించాము. DEET యాంజియోజెనిసిస్‌కు దారితీసే సెల్యులార్ ప్రక్రియలను సక్రియం చేస్తుంది, వీటిలో విస్తరణ, వలస మరియు సంశ్లేషణ ఉన్నాయి. ఇది ఎండోథెలియల్ కణాలలో పెరిగిన NO ఉత్పత్తి మరియు VEGF వ్యక్తీకరణతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. M3 ని నిశ్శబ్దం చేయడం లేదా ఫార్మకోలాజికల్ M3 ఇన్హిబిటర్‌లను ఉపయోగించడం ఈ ప్రభావాలన్నింటినీ రద్దు చేసింది, DEET-ప్రేరిత యాంజియోజెనిసిస్ M3-సెన్సిటివ్ అని సూచిస్తుంది. M3 గ్రాహకాలను అతిగా ఎక్స్‌ప్రెస్ చేసే ఎండోథెలియల్ మరియు HEK కణాలలో కాల్షియం సిగ్నలింగ్‌తో కూడిన ప్రయోగాలు, అలాగే బైండింగ్ మరియు డాకింగ్ అధ్యయనాలు, DEET M3 గ్రాహకాల యొక్క అలోస్టెరిక్ మాడ్యులేటర్‌గా పనిచేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. ఇంకా, DEET ACHE ని నిరోధిస్తుంది, తద్వారా ఎసిటైల్‌కోలిన్ యొక్క జీవ లభ్యత మరియు M3 గ్రాహకాలకు దాని బంధాన్ని పెంచుతుంది మరియు అలోస్టెరిక్ నియంత్రణ ద్వారా ప్రోయాంజియోజెనిక్ ప్రభావాలను పెంచుతుంది.
ప్రాథమిక EC లను స్విస్ ఎలుకల బృహద్ధమని నుండి వేరు చేశారు. వెలికితీత పద్ధతి కోబయాషి ప్రోటోకాల్ 26 నుండి స్వీకరించబడింది. మురిన్ EC లను నాల్గవ పాసేజ్ వరకు 5% వేడి-నిష్క్రియం చేయబడిన FBS తో అనుబంధంగా EBM-2 మాధ్యమంలో కల్చర్ చేశారు.
HUVEC, U87MG, లేదా BF16F10 యొక్క విస్తరణపై రెండు సాంద్రతల DEET ప్రభావాన్ని CyQUANT సెల్ ప్రోలిఫరేషన్ అస్సే కిట్ (మాలిక్యులర్ ప్రోబ్స్, C7026) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు. క్లుప్తంగా, ప్రతి బావికి 5.103 కణాలను 96-బావి ప్లేట్‌లో సీడ్ చేసి, రాత్రిపూట అటాచ్ చేయడానికి అనుమతించారు, ఆపై 24 గంటలు DEETతో చికిత్స చేశారు. గ్రోత్ మీడియంను తీసివేసిన తర్వాత, మైక్రోప్లేట్ యొక్క ప్రతి బావికి డై బైండింగ్ ద్రావణాన్ని జోడించి, 30 నిమిషాల పాటు 37 °C వద్ద కణాలను పొదిగించండి. 485 nm ఉత్తేజిత ఫిల్టర్లు మరియు 530 nm ఉద్గార ఫిల్టర్‌లతో అమర్చబడిన మిత్రాస్ LB940 మల్టీమోడ్ మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (బెర్తోల్డ్ టెక్నాలజీస్, బాడ్ వైల్డ్‌బాడ్, జర్మనీ) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ స్థాయిలను నిర్ణయించారు.
HUVEC లను 96-బావి పలకలలో ప్రతి బావికి 104 కణాల సాంద్రతతో సీడ్ చేశారు. కణాలను DEET తో 24 గంటలు చికిత్స చేశారు. కలర్మెట్రిక్ MTT అస్సే (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, M5655) ఉపయోగించి కణ సాధ్యతను అంచనా వేశారు. 570 nm తరంగదైర్ఘ్యం వద్ద మల్టీమోడ్ మైక్రోప్లేట్ రీడర్ (మిత్రాస్ LB940) పై ఆప్టికల్ డెన్సిటీ విలువలను పొందారు.
DEET యొక్క ప్రభావాలను ఇన్ విట్రో యాంజియోజెనిసిస్ అస్సేలను ఉపయోగించి అధ్యయనం చేశారు. 10-8 M లేదా 10-5 M DEET తో చికిత్స HUVEC లలో కేశనాళిక పొడవు ఏర్పడటాన్ని పెంచింది (Fig. 1a, b, తెల్లటి బార్లు). నియంత్రణ సమూహంతో పోలిస్తే, 10-14 నుండి 10-5 M వరకు ఉన్న DEET సాంద్రతలతో చికిత్స 10-8 M DEET వద్ద కేశనాళిక పొడవు ఒక పీఠభూమికి చేరుకుందని చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం S2). 10-8 M మరియు 10-5 M గాఢత పరిధిలో DEET తో చికిత్స చేయబడిన HUVEC ల యొక్క ఇన్ విట్రో ప్రోయాంజియోజెనిక్ ప్రభావంలో గణనీయమైన తేడా కనుగొనబడలేదు.
నియోవాస్కులరైజేషన్ పై DEET ప్రభావాన్ని నిర్ణయించడానికి, మేము వివో నియోవాస్కులరైజేషన్ అధ్యయనాలను నిర్వహించాము. 14 రోజుల తర్వాత, 10-8 M లేదా 10-5 M DEET తో ప్రీకల్చర్ చేయబడిన ఎండోథెలియల్ కణాలతో ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఎలుకలలో హిమోగ్లోబిన్ కంటెంట్‌లో గణనీయమైన పెరుగుదల కనిపించింది (Fig. 1c, తెల్లటి బార్‌లు).
ఇంకా, DEET-ప్రేరిత నియోవాస్కులరైజేషన్ U87MG జెనోగ్రాఫ్ట్-బేరింగ్ ఎలుకలలో అధ్యయనం చేయబడింది, వీటిని ప్రతిరోజూ (ip) DEET తో ఇంజెక్ట్ చేశారు, ఇది 10-5 M ప్లాస్మా సాంద్రతలను ప్రేరేపించే మోతాదులో ఉంటుంది, ఇది బహిర్గతమైన మానవులలో సాధారణం. 23 లో. U87MG కణాలను ఎలుకలలోకి ఇంజెక్ట్ చేసిన 14 రోజుల తర్వాత గుర్తించదగిన కణితులు (అంటే కణితులు >100 mm3) గమనించబడ్డాయి. 28వ రోజు, నియంత్రణ ఎలుకలతో పోలిస్తే DEET-చికిత్స చేయబడిన ఎలుకలలో కణితి పెరుగుదల గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 1d, చతురస్రాలు). ఇంకా, కణితుల యొక్క CD31 మరక DEET కేశనాళిక ప్రాంతాన్ని గణనీయంగా పెంచిందని చూపించింది కానీ మైక్రోవెస్సెల్ సాంద్రతను కాదు. (Fig. 1e-g).
DETA-ప్రేరిత విస్తరణలో మస్కారినిక్ గ్రాహకాల పాత్రను నిర్ణయించడానికి, pFHHSiD (10-7 M, ఎంపిక చేసిన M3 గ్రాహక విరోధి) సమక్షంలో 10-8 M లేదా 10-5 M DETA ఉపయోగించబడింది. HUVEC చికిత్స. pFHHSiD అన్ని సాంద్రతలలో DETA యొక్క విస్తరణ లక్షణాలను పూర్తిగా నిరోధించింది (టేబుల్ 1).
ఈ పరిస్థితులలో, DEET HUVEC కణాలలో కేశనాళిక పొడవును పెంచుతుందా అని కూడా మేము పరిశీలించాము. అదేవిధంగా, pFHHSiD DEET-ప్రేరిత కేశనాళిక పొడవును గణనీయంగా నిరోధించింది (Fig. 1a, b, బూడిద రంగు బార్‌లు). ఇంకా, M3 siRNAతో ఇలాంటి ప్రయోగాలు జరిగాయి. కేశనాళిక నిర్మాణాన్ని ప్రోత్సహించడంలో నియంత్రణ siRNA ప్రభావవంతంగా లేనప్పటికీ, M3 మస్కారినిక్ గ్రాహకాన్ని నిశ్శబ్దం చేయడం వల్ల కేశనాళిక పొడవును పెంచే DEET సామర్థ్యాన్ని రద్దు చేసింది (Fig. 1a, b, నల్లని బార్‌లు).
ఇంకా, 10-8 M లేదా 10-5 M DEET-ప్రేరిత వాస్కులరైజేషన్ ఇన్ విట్రో మరియు నియోవాస్కులరైజేషన్ ఇన్ వివో రెండూ pFHHSiD ద్వారా పూర్తిగా నిరోధించబడ్డాయి (Fig. 1c, d, వృత్తాలు). ఈ ఫలితాలు DEET సెలెక్టివ్ M3 రిసెప్టర్ యాంటీగోనిస్ట్‌లు లేదా M3 siRNAకి సున్నితమైన మార్గం ద్వారా యాంజియోజెనిసిస్‌ను ప్రోత్సహిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
ACHE అనేది DEET యొక్క పరమాణు లక్ష్యం. ACHE నిరోధకాలుగా పనిచేసే డోనెపెజిల్ వంటి మందులు, ఇన్ విట్రో మరియు మౌస్ హిండ్లింబ్ ఇస్కీమియా నమూనాలలో EC యాంజియోజెనిసిస్‌ను ప్రేరేపించగలవు14. HUVECలో ACHE ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలపై రెండు సాంద్రతల DEET ప్రభావాన్ని మేము పరీక్షించాము. నియంత్రణ పరిస్థితులతో పోలిస్తే DEET యొక్క తక్కువ (10-8 M) మరియు అధిక (10-5 M) సాంద్రతలు ఎండోథెలియల్ ACHE కార్యకలాపాలను తగ్గించాయి (Fig. 2).
DEET (10-8 M మరియు 10-5 M) యొక్క రెండు సాంద్రతలు HUVEC పై ఎసిటైల్కోలినెస్టెరేస్ కార్యకలాపాలను తగ్గించాయి. BW284c51 (10-5 M) ను ఎసిటైల్కోలినెస్టెరేస్ నిరోధకాలకు నియంత్రణగా ఉపయోగించారు. వాహనం-చికిత్స చేసిన కణాలతో పోలిస్తే DEET యొక్క రెండు సాంద్రతలతో చికిత్స చేయబడిన HUVEC పై ACHE కార్యాచరణ శాతంగా ఫలితాలు వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. విలువలు ఆరు స్వతంత్ర ప్రయోగాల సగటు ± SEM గా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. *p < 0.05 నియంత్రణతో పోలిస్తే (క్రుస్కల్-వాలిస్ మరియు డన్ బహుళ పోలిక పరీక్ష).
నైట్రిక్ ఆక్సైడ్ (NO) ఆంజియోజెనిక్ ప్రక్రియ 33 లో పాల్గొంటుంది, కాబట్టి, DEET- ఉత్తేజిత HUVEC లలో NO ఉత్పత్తిని అధ్యయనం చేశారు. నియంత్రణ కణాలతో పోలిస్తే DEET- చికిత్స చేయబడిన ఎండోథెలియల్ NO ఉత్పత్తి పెరిగింది, కానీ 10-8 M మోతాదులో మాత్రమే ప్రాముఖ్యతను చేరుకుంది (Fig. 3c). DEET- ప్రేరిత NO ఉత్పత్తిని నియంత్రించే పరమాణు మార్పులను నిర్ణయించడానికి, eNOS వ్యక్తీకరణ మరియు క్రియాశీలతను వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు. DEET చికిత్స eNOS వ్యక్తీకరణను మార్చనప్పటికీ, eNOS ఫాస్ఫోరైలేషన్‌లోని చికిత్స చేయని కణాలతో పోలిస్తే దాని నిరోధక సైట్ (Thr-495) ను తగ్గిస్తూ దాని యాక్టివేటింగ్ సైట్ (Ser-1177) వద్ద eNOS ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను గణనీయంగా పెంచింది (Fig. 3d). ఇంకా, యాక్టివేషన్ సైట్ మరియు ఇన్హిబిటరీ సైట్ వద్ద ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ eNOS మొత్తాన్ని ఎంజైమ్ మొత్తం మొత్తానికి సాధారణీకరించిన తర్వాత యాక్టివేషన్ సైట్ మరియు ఇన్హిబిటరీ సైట్ వద్ద ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ eNOS నిష్పత్తిని లెక్కించారు. చికిత్స చేయని కణాలతో పోలిస్తే DEET యొక్క ప్రతి సాంద్రతతో చికిత్స చేయబడిన HUVEC లలో ఈ నిష్పత్తి గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 3d).
చివరగా, ప్రధాన ప్రోయాంజియోజెనిక్ కారకాలలో ఒకటైన VEGF యొక్క వ్యక్తీకరణను వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ ద్వారా విశ్లేషించారు. DEET VEGF వ్యక్తీకరణను గణనీయంగా పెంచింది, అయితే pFHHSiD ఈ వ్యక్తీకరణను పూర్తిగా నిరోధించింది.
DEET యొక్క ప్రభావాలు ఔషధ నిరోధకం మరియు M3 గ్రాహకాల యొక్క నియంత్రణను తగ్గించడం రెండింటికీ సున్నితంగా ఉంటాయి కాబట్టి, DEET కాల్షియం సిగ్నలింగ్‌ను పెంచుతుందనే పరికల్పనను మేము పరీక్షించాము. ఆశ్చర్యకరంగా, ఉపయోగించిన రెండు సాంద్రతలకు HUVEC (డేటా చూపబడలేదు) మరియు HEK/M3 (Fig. 4a, b) లలో సైటోప్లాస్మిక్ కాల్షియంను పెంచడంలో DEET విఫలమైంది.