కాండం అగ్రస్థాన మెరిస్టెమ్‌లో అంతర కణుపుల నిర్దేశంలో గిబ్బరెల్లిన్‌ల పాత్రను పరిమాణాత్మక గిబ్బరెల్లిన్ బయోసెన్సర్ వెల్లడిస్తుంది

కాండం నిర్మాణానికి షూట్ అపికల్ మెరిస్టెమ్ (SAM) పెరుగుదల చాలా కీలకం. మొక్కల హార్మోన్లుగిబ్బరెల్లిన్లుమొక్కల పెరుగుదలను సమన్వయం చేయడంలో GAలు కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి, కానీ SAMలో వాటి పాత్ర గురించి ఇంకా సరిగా అర్థం కాలేదు. ఇక్కడ, మేము GA ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ప్రతిస్పందనలో దాని ముఖ్యమైన నియంత్రణ విధిని అణచివేస్తూ, GAను గుర్తించినప్పుడు దాని క్షీణతను కాపాడేలా DELLA ప్రోటీన్‌ను ఇంజనీరింగ్ చేయడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ యొక్క రేషియోమెట్రిక్ బయోసెన్సార్‌ను అభివృద్ధి చేశాము. ఈ క్షీణత-ఆధారిత బయోసెన్సార్, అభివృద్ధి సమయంలో GA స్థాయిలలో మరియు సెల్యులార్ సెన్సింగ్‌లో వచ్చే మార్పులను కచ్చితంగా నమోదు చేస్తుందని మేము నిరూపిస్తున్నాము. SAMలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను మ్యాప్ చేయడానికి మేము ఈ బయోసెన్సార్‌ను ఉపయోగించాము. అధిక GA సంకేతాలు ప్రధానంగా ఆర్గాన్ ప్రిమోర్డియాల మధ్య ఉన్న కణాలలో ఉంటాయని మేము చూపిస్తున్నాము; ఈ ఆర్గాన్ ప్రిమోర్డియాలు ఇంటర్నోడ్ కణాలకు పూర్వగాములు. గెయిన్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ మరియు లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ పద్ధతులను ఉపయోగించి, GA కణ విభజన తలం యొక్క దిశను నియంత్రిస్తుందని, ఇంటర్నోడ్ల యొక్క ప్రామాణిక సెల్యులార్ నిర్మాణాన్ని స్థాపిస్తుందని, తద్వారా SAMలో ఇంటర్నోడ్ నిర్దిష్టతను ప్రోత్సహిస్తుందని మేము మరింతగా నిరూపిస్తున్నాము.
కాండం కొన వద్ద ఉండే షూట్ అపికల్ మెరిస్టెమ్ (SAM), కాండ కణాల యొక్క ఒక ప్రత్యేక సమూహాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ఈ కణాల కార్యాచరణ, మొక్క యొక్క జీవితకాలమంతా ఒక క్రమబద్ధమైన మరియు పునరావృత పద్ధతిలో పార్శ్వ అవయవాలను మరియు కాండ కణుపులను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఈ పునరావృతమయ్యే యూనిట్లలో, లేదా మొక్క కణుపులలో ప్రతి ఒక్కటి, కణుపుల వద్ద ఇంటర్నోడ్లు మరియు పార్శ్వ అవయవాలను, మరియు ఆకు గ్రీవాలలో యాక్సిలరీ మెరిస్టెమ్‌లను కలిగి ఉంటుంది¹. అభివృద్ధి చెందుతున్నప్పుడు మొక్క కణుపుల పెరుగుదల మరియు నిర్మాణం మారుతుంది. అరాబిడోప్సిస్‌లో, వృక్ష దశలో ఇంటర్నోడల్ పెరుగుదల అణచివేయబడుతుంది, మరియు రోసెట్ ఆకుల గ్రీవాలలో యాక్సిలరీ మెరిస్టెమ్‌లు నిద్రాణంగా ఉంటాయి. పుష్ప దశకు మారే సమయంలో, SAM పుష్పగుచ్ఛ మెరిస్టెమ్‌గా మారి, పొడవైన ఇంటర్నోడ్లు మరియు యాక్సిలరీ మొగ్గలు, కాండపు ఆకుల గ్రీవాలలో చిన్న కొమ్మలు, మరియు తరువాత, ఆకులు లేని పువ్వులను ఉత్పత్తి చేస్తుంది². ఆకులు, పువ్వులు మరియు కొమ్మల ఆవిర్భావాన్ని నియంత్రించే యంత్రాంగాలను అర్థం చేసుకోవడంలో మనం గణనీయమైన పురోగతి సాధించినప్పటికీ, ఇంటర్నోడ్లు ఎలా ఏర్పడతాయనే దాని గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.
GAల యొక్క దేశకాలిక విస్తరణను అర్థం చేసుకోవడం, వివిధ కణజాలాలలో మరియు వివిధ అభివృద్ధి దశలలో ఈ హార్మోన్ల విధులను మరింత బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది. దాని స్వంత ప్రమోటర్ చర్య కింద వ్యక్తమయ్యే RGA-GFP ఫ్యూజన్ యొక్క క్షీణతను దృశ్యమానం చేయడం, వేర్లలో మొత్తం GA స్థాయిల నియంత్రణపై ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుంది¹⁵,¹⁶. అయితే, RGA వ్యక్తీకరణ కణజాలాల వారీగా మారుతుంది¹⁷ మరియు GA¹⁸ ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది. అందువల్ల, RGA ప్రమోటర్ యొక్క భేదాత్మక వ్యక్తీకరణ, RGA-GFPతో గమనించిన ఫ్లోరోసెన్స్ నమూనాకు దారితీయవచ్చు మరియు అందువల్ల ఈ పద్ధతి పరిమాణాత్మకమైనది కాదు. ఇటీవలే, జీవక్రియాశీల ఫ్లోరోసెయిన్ (Fl)-లేబుల్ చేయబడిన GA¹⁹,²⁰, వేరు ఎండోకార్టెక్స్‌లో GA పేరుకుపోవడాన్ని మరియు GA రవాణా ద్వారా దాని కణస్థాయిల నియంత్రణను వెల్లడించింది. ఇటీవల, GA FRET సెన్సార్ nlsGPS1, వేర్లు, కేసరాలు మరియు చీకటిలో పెరిగిన హైపోకోటిల్స్‌లో కణాల పొడవు పెరగడంతో GA స్థాయిలు సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది²¹. అయితే, మనం చూసినట్లుగా, GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను నియంత్రించే ఏకైక పరామితి GA గాఢత మాత్రమే కాదు, ఎందుకంటే ఇది సంక్లిష్టమైన సెన్సింగ్ ప్రక్రియలపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఇక్కడ, DELLA మరియు GA సిగ్నలింగ్ మార్గాలపై మాకున్న అవగాహనను ఆధారంగా చేసుకుని, GA సిగ్నలింగ్ కోసం ఒక క్షీణత-ఆధారిత రేషియోమెట్రిక్ బయోసెన్సార్ యొక్క అభివృద్ధి మరియు లక్షణీకరణను మేము నివేదిస్తున్నాము. ఈ పరిమాణాత్మక బయోసెన్సార్‌ను అభివృద్ధి చేయడానికి, మేము ఒక ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌తో సంలీనం చేయబడి కణజాలాలలో సర్వత్రా వ్యక్తమయ్యే ఒక మ్యూటెంట్ GA-సున్నితమైన RGAను, అలాగే ఒక GA-సున్నితత్వం లేని ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌ను ఉపయోగించాము. మ్యూటెంట్ RGA ప్రోటీన్ సంలీనాలు సర్వత్రా వ్యక్తమైనప్పుడు అంతర్గత GA సిగ్నలింగ్‌కు ఆటంకం కలిగించవని, మరియు ఈ బయోసెన్సార్ అధిక ప్రాదేశిక-కాలిక రిజల్యూషన్‌తో, సెన్సింగ్ ఉపకరణం ద్వారా జరిగే GA ఇన్‌పుట్ మరియు GA సిగ్నల్ ప్రాసెసింగ్ రెండింటి ఫలితంగా ఏర్పడే సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను పరిమాణీకరించగలదని మేము చూపిస్తున్నాము. GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క ప్రాదేశిక-కాలిక విస్తరణను మ్యాప్ చేయడానికి మరియు SAM బాహ్యచర్మంలో GA కణ ప్రవర్తనను ఎలా నియంత్రిస్తుందో పరిమాణీకరించడానికి మేము ఈ బయోసెన్సార్‌ను ఉపయోగించాము. అవయవ ప్రాథమికాల మధ్య ఉన్న SAM కణాల విభజన తలం యొక్క దిశను GA నియంత్రిస్తుందని, తద్వారా ఇంటర్నోడ్ యొక్క ప్రామాణిక కణ నిర్మాణాన్ని నిర్వచిస్తుందని మేము ప్రదర్శిస్తున్నాము.
చివరగా, పెరుగుతున్న హైపోకోటిల్స్‌ను ఉపయోగించి అంతర్గత GA స్థాయిలలో మార్పులను qmRGA నివేదించగలదా అని మేము ప్రశ్నించాము. నైట్రేట్, GA సంశ్లేషణను మరియు తద్వారా DELLA34 క్షీణతను పెంచడం ద్వారా పెరుగుదలను ప్రేరేపిస్తుందని మేము గతంలో చూపించాము. దానికి అనుగుణంగా, అధిక నైట్రేట్ సరఫరా (10 mM NO3−) కింద పెరిగిన pUBQ10::qmRGA మొలకలలోని హైపోకోటిల్ పొడవు, నైట్రేట్-లోపం ఉన్న పరిస్థితులలో పెరిగిన మొలకలలోని పొడవు కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని మేము గమనించాము (అనుబంధ చిత్రం 6a). పెరుగుదల ప్రతిస్పందనకు అనుగుణంగా, నైట్రేట్ లేని పరిస్థితులలో పెరిగిన మొలకల కంటే 10 mM NO3− పరిస్థితులలో పెరిగిన మొలకల హైపోకోటిల్స్‌లో GA సంకేతాలు ఎక్కువగా ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 6b, c). అందువల్ల, GA గాఢతలో అంతర్గత మార్పుల ద్వారా ప్రేరేపించబడిన GA సిగ్నలింగ్‌లోని మార్పులను పర్యవేక్షించడానికి కూడా qmRGA వీలు కల్పిస్తుంది.
సెన్సార్ రూపకల్పన ఆధారంగా ఊహించినట్లుగా, qmRGA ద్వారా గుర్తించబడిన GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపం GA గాఢత మరియు GA గ్రహణశక్తిపై ఆధారపడి ఉంటుందా లేదా అని అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము వృక్షసంబంధ మరియు ప్రత్యుత్పత్తి కణజాలాలలో మూడు GID1 గ్రాహకాల వ్యక్తీకరణను విశ్లేషించాము. మొలకలలో, GID1-GUS రిపోర్టర్ లైన్, GID1a మరియు c బీజదళాలలో అధికంగా వ్యక్తీకరించబడ్డాయని చూపించింది (పటం 3a–c). అదనంగా, ఈ మూడు గ్రాహకాలు ఆకులు, పార్శ్వ వేరు మొగ్గలు, వేరు కొనలు (GID1b యొక్క వేరు తొడుగు మినహా), మరియు నాళికా వ్యవస్థలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి (పటం 3a–c). పుష్పగుచ్ఛం SAMలో, మేము GID1b మరియు 1c కోసం మాత్రమే GUS సంకేతాలను గుర్తించాము (అనుబంధ పటం 7a–c). ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ ఈ వ్యక్తీకరణ నమూనాలను ధృవీకరించింది మరియు GID1c SAMలో తక్కువ స్థాయిలో ఏకరీతిగా వ్యక్తీకరించబడిందని, అయితే GID1b SAM యొక్క పరిధిలో అధిక వ్యక్తీకరణను చూపించిందని మరింతగా ప్రదర్శించింది (అనుబంధ పటం 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b ట్రాన్స్‌లేషనల్ ఫ్యూజన్, SAM మధ్యలో తక్కువ లేదా అసలు వ్యక్తీకరణ లేకపోవడం నుండి అవయవాల అంచుల వద్ద అధిక వ్యక్తీకరణ వరకు, GID1b వ్యక్తీకరణలో ఒక క్రమబద్ధమైన శ్రేణిని కూడా వెల్లడించింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 7m). అందువల్ల, GID1 గ్రాహకాలు కణజాలాల అంతటా మరియు లోపల ఏకరీతిగా పంపిణీ చేయబడవు. తదుపరి ప్రయోగాలలో, GID1 యొక్క అధిక వ్యక్తీకరణ (pUBQ10::GID1a-mCherry) హైపోకోటిల్స్‌లో బాహ్య GA అనువర్తనానికి qmRGA యొక్క సున్నితత్వాన్ని పెంచిందని కూడా మేము గమనించాము (ఫిగర్ 3d, e). దీనికి విరుద్ధంగా, హైపోకోటిల్‌లో qd17mRGA ద్వారా కొలవబడిన ఫ్లోరోసెన్స్ GA3 చికిత్సకు సున్నితత్వం చూపలేదు (ఫిగర్ 3f, g). రెండు అస్సేల కోసం, సెన్సార్ యొక్క వేగవంతమైన ప్రవర్తనను అంచనా వేయడానికి మొలకలకు అధిక సాంద్రతలలో GA (100 μM GA3) తో చికిత్స చేయబడింది, దీనిలో GID1 గ్రాహకానికి బంధించే సామర్థ్యం పెరిగింది లేదా కోల్పోయింది. ఈ ఫలితాలు అన్నీ కలిసి, qmRGA బయోసెన్సార్ GA మరియు GA సెన్సార్‌గా సంయుక్త విధిని నిర్వర్తిస్తుందని నిర్ధారిస్తాయి, మరియు GID1 గ్రాహకం యొక్క భేదాత్మక వ్యక్తీకరణ సెన్సార్ యొక్క ఉద్గారతను గణనీయంగా మాడ్యులేట్ చేయగలదని సూచిస్తాయి.
ఇప్పటి వరకు, SAMలో GA సంకేతాల పంపిణీ అస్పష్టంగానే ఉంది. అందువల్ల, SAM పెరుగుదలను నియంత్రించడంలో L1 కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది కాబట్టి, మేము L1 పొర (బాహ్యచర్మం; పటం 4a, b, పద్ధతులు మరియు అనుబంధ పద్ధతులు చూడండి) పై దృష్టి సారిస్తూ, GA సంకేత కార్యకలాపాల యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ పరిమాణాత్మక పటాలను లెక్కించడానికి qmRGA-వ్యక్తీకరించే మొక్కలు మరియు pCLV3::mCherry-NLS మూల కణ రిపోర్టర్35ను ఉపయోగించాము36. ఇక్కడ, pCLV3::mCherry-NLS వ్యక్తీకరణ, GA సంకేత కార్యకలాపాల యొక్క దేశకాలిక పంపిణీని విశ్లేషించడానికి ఒక స్థిరమైన జ్యామితీయ సూచన బిందువును అందించింది37. పార్శ్వ అవయవాల అభివృద్ధికి GA అవసరమైనదిగా పరిగణించబడినప్పటికీ4, P3 దశ నుండి పుష్ప ప్రాథమికాంశం (P)లో GA సంకేతాలు తక్కువగా ఉన్నాయని మేము గమనించాము (పటం 4a, b), అయితే యువ P1 మరియు P2 ప్రాథమికాంశాలు మధ్య ప్రాంతంలో ఉన్నదానితో సమానంగా మధ్యస్థ కార్యకలాపాలను కలిగి ఉన్నాయి (పటం 4a, b). అవయవ ప్రాథమిక కణాల సరిహద్దుల వద్ద, P1/P2 (సరిహద్దుకు ఇరువైపులా) నుండి ప్రారంభమై P4 వద్ద గరిష్ట స్థాయికి చేరుకుంటూ, అలాగే ప్రాథమిక కణాల మధ్య ఉన్న పరిధీయ ప్రాంతంలోని అన్ని కణాలలో అధిక GA సంకేత క్రియాశీలత గుర్తించబడింది (పటం 4a, b మరియు అనుబంధ పటం 8a, b). ఈ అధిక GA సంకేత క్రియాశీలత బాహ్యచర్మంలో మాత్రమే కాకుండా L2 మరియు పై L3 పొరలలో కూడా గమనించబడింది (అనుబంధ పటం 8b). qmRGA ఉపయోగించి SAMలో గుర్తించిన GA సంకేతాల నమూనా కూడా కాలక్రమేణా మారకుండా ఉంది (అనుబంధ పటం 8c–f, k). మేము వివరంగా వర్గీకరించిన ఐదు స్వతంత్ర లైన్‌ల నుండి వచ్చిన T3 మొక్కల SAMలో qd17mRGA నిర్మాణం క్రమపద్ధతిలో తగ్గించబడినప్పటికీ, మేము pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP నిర్మాణంతో పొందిన ఫ్లోరోసెన్స్ నమూనాలను విశ్లేషించగలిగాము (అనుబంధ పటం 8g–j, l). ఈ నియంత్రణ రేఖలో, SAMలో ఫ్లోరోసెన్స్ నిష్పత్తిలో స్వల్ప మార్పులు మాత్రమే గుర్తించబడ్డాయి, కానీ SAM కేంద్రంలో TagBFPతో సంబంధం ఉన్న VENUSలో స్పష్టమైన మరియు ఊహించని తగ్గుదలను మేము గమనించాము. ఇది qmRGA ద్వారా గమనించిన సిగ్నలింగ్ నమూనా, mRGA-VENUS యొక్క GA-ఆధారిత క్షీణతను ప్రతిబింబిస్తుందని నిర్ధారిస్తుంది, కానీ qmRGA మెరిస్టెమ్ కేంద్రంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను అతిగా అంచనా వేయవచ్చని కూడా ప్రదర్శిస్తుంది. సారాంశంలో, మా ఫలితాలు ప్రాథమికంగా ప్రిమోర్డియా పంపిణీని ప్రతిబింబించే GA సిగ్నలింగ్ నమూనాను వెల్లడిస్తున్నాయి. ఇంటర్-ప్రిమోర్డియల్ రీజియన్ (IPR) యొక్క ఈ పంపిణీకి కారణం, అభివృద్ధి చెందుతున్న ప్రిమోర్డియం మరియు కేంద్ర ప్రాంతం మధ్య అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ క్రమంగా ఏర్పడటం, అదే సమయంలో ప్రిమోర్డియంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ తగ్గడం (Fig. 4c, d).
GID1b మరియు GID1c గ్రాహకాల పంపిణీ (పైన చూడండి) GA గ్రాహకాల యొక్క భేదాత్మక వ్యక్తీకరణ SAMలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల నమూనాను రూపొందించడంలో సహాయపడుతుందని సూచిస్తుంది. GA యొక్క భేదాత్మక సంచయం ఇందులో పాలుపంచుకోవచ్చా అని మేము ఆశ్చర్యపోయాము. ఈ అవకాశాన్ని పరిశోధించడానికి, మేము nlsGPS1 GA FRET సెన్సార్21ను ఉపయోగించాము. 100 నిమిషాల పాటు 10 μM GA4+7తో చికిత్స పొందిన nlsGPS1 యొక్క SAMలో పెరిగిన యాక్టివేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ కనుగొనబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 9a–e), ఇది వేర్లలో21 వలెనే, nlsGPS1 కూడా SAMలోని GA సాంద్రతలో మార్పులకు ప్రతిస్పందిస్తుందని సూచిస్తుంది. nlsGPS1 యాక్టివేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ యొక్క ప్రాదేశిక పంపిణీ SAM యొక్క బయటి పొరలలో సాపేక్షంగా తక్కువ GA స్థాయిలను వెల్లడించింది, కానీ అవి SAM మధ్యలో మరియు సరిహద్దులలో పెరిగాయని చూపించింది (ఫిగర్ 4e మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 9a,c). ఇది qmRGA ద్వారా వెల్లడైన ప్రాదేశిక నమూనాతో పోల్చదగిన విధంగా GA కూడా SAMలో పంపిణీ చేయబడిందని సూచిస్తుంది. ఒక పరిపూరక విధానంగా, మేము SAMను ఫ్లోరోసెంట్ GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl)తో లేదా నెగటివ్ కంట్రోల్‌గా Flతో మాత్రమే ట్రీట్ చేశాము. Fl సిగ్నల్ తక్కువ తీవ్రతతో ఉన్నప్పటికీ, కేంద్ర ప్రాంతం మరియు ప్రిమోర్డియంతో సహా SAM అంతటా విస్తరించింది (Fig. 4j మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 10d). దీనికి విరుద్ధంగా, మూడు GA-Flలు ప్రత్యేకంగా ప్రిమోర్డియం సరిహద్దులలో మరియు మిగిలిన IPRలో వివిధ స్థాయిలలో పేరుకుపోయాయి, GA7-Fl IPRలోని అతిపెద్ద డొమైన్‌లో పేరుకుపోయింది (Fig. 4k మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 10a,b). ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రతను లెక్కించగా, Fl-ట్రీట్ చేసిన SAMతో పోలిస్తే GA-Fl-ట్రీట్ చేసిన SAMలో IPR మరియు నాన్-IPR తీవ్రతల నిష్పత్తి ఎక్కువగా ఉందని వెల్లడైంది (Fig. 4l మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 10c). ఈ ఫలితాలన్నీ కలిసి, అవయవ సరిహద్దుకు అత్యంత సమీపంలో ఉన్న IPR కణాలలో GA అధిక సాంద్రతలలో ఉంటుందని సూచిస్తున్నాయి. దీనిని బట్టి, SAM GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల నమూనా అనేది GA గ్రాహకాల యొక్క భేదాత్మక వ్యక్తీకరణ మరియు అవయవ సరిహద్దుల సమీపంలోని IPR కణాలలో GA యొక్క భేదాత్మక సంచయం రెండింటి ఫలితంగా ఏర్పడుతుందని తెలుస్తుంది. అందువల్ల, మా విశ్లేషణ GA సిగ్నలింగ్ యొక్క ఊహించని దేశకాలిక నమూనాను వెల్లడించింది, దీనిలో SAM యొక్క కేంద్రం మరియు ప్రిమోర్డియంలో తక్కువ కార్యకలాపం మరియు పరిధీయ ప్రాంతంలోని IPRలో అధిక కార్యకలాపం ఉంది.
SAMలో భేదాత్మక GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల పాత్రను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS యొక్క రియల్-టైమ్ టైమ్-లాప్స్ ఇమేజింగ్‌ను ఉపయోగించి GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపం, కణ విస్తరణ మరియు కణ విభజన మధ్య సహసంబంధాన్ని విశ్లేషించాము. పెరుగుదల నియంత్రణలో GA పాత్రను బట్టి, కణ విస్తరణ పారామితులతో సానుకూల సహసంబంధం ఉంటుందని ఊహించబడింది. అందువల్ల, మేము మొదట GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాప పటాలను కణ ఉపరితల పెరుగుదల రేటు పటాలతో (ఇచ్చిన కణం మరియు విభజన వద్ద ఉన్న కుమార్తె కణాల కోసం కణ విస్తరణ బలానికి ప్రాక్సీగా) మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ పటాలతో పోల్చాము, ఇది కణ విస్తరణ యొక్క దిశను కొలుస్తుంది (ఇక్కడ కూడా ఇచ్చిన కణం మరియు విభజన వద్ద ఉన్న కుమార్తె కణాల కోసం ఉపయోగించబడింది; Fig. 5a,b, పద్ధతులు మరియు అనుబంధ పద్ధతులు చూడండి). మా SAM కణ ఉపరితల పెరుగుదల రేటు పటాలు మునుపటి పరిశీలనలకు38,39 అనుగుణంగా ఉన్నాయి, సరిహద్దు వద్ద కనిష్ట పెరుగుదల రేట్లు మరియు అభివృద్ధి చెందుతున్న పువ్వులలో గరిష్ట పెరుగుదల రేట్లు ఉన్నాయి (Fig. 5a). ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపం కణ ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రతతో ప్రతికూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉందని చూపించింది (Figure 5c). GA సిగ్నలింగ్ ఇన్‌పుట్ మరియు పెరుగుదల తీవ్రతతో సహా, వైవిధ్యం యొక్క ప్రధాన అక్షాలు అధిక CLV3 వ్యక్తీకరణ ద్వారా నిర్ణయించబడిన దిశకు లంబంగా ఉన్నాయని కూడా మేము చూపించాము, ఇది మిగిలిన విశ్లేషణలలో SAM కేంద్రం నుండి కణాలను మినహాయించడాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. స్పియర్‌మన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ PCA ఫలితాలను ధృవీకరించింది (పటం 5d), IPRలో అధిక GA సంకేతాలు అధిక కణ విస్తరణకు దారితీయలేదని సూచిస్తుంది. అయితే, సహసంబంధ విశ్లేషణ GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ మధ్య స్వల్ప సానుకూల సహసంబంధాన్ని వెల్లడించింది (పటం 5c, d), ఇది IPRలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కణ పెరుగుదల దిశను మరియు బహుశా కణ విభజన తలం యొక్క స్థానాన్ని ప్రభావితం చేస్తుందని సూచిస్తుంది.
a, b ఏడు స్వతంత్ర మొక్కల నుండి సగటున తీసుకున్న SAM లోని సగటు ఉపరితల పెరుగుదల (a) మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ (b) యొక్క హీట్ మ్యాప్‌లు (ఇవి వరుసగా కణ విస్తరణ యొక్క బలం మరియు దిశకు ప్రాక్సీలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి). c PCA విశ్లేషణలో ఈ క్రింది వేరియబుల్స్ ఉన్నాయి: GA సిగ్నల్, ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రత, ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ, మరియు CLV3 వ్యక్తీకరణ. PCA కాంపోనెంట్ 1 ప్రధానంగా ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రతతో ప్రతికూల సహసంబంధం కలిగి ఉంది మరియు GA సిగ్నల్‌తో సానుకూల సహసంబంధం కలిగి ఉంది. PCA కాంపోనెంట్ 2 ప్రధానంగా ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపీతో సానుకూల సహసంబంధం కలిగి ఉంది మరియు CLV3 వ్యక్తీకరణతో ప్రతికూల సహసంబంధం కలిగి ఉంది. శాతాలు ప్రతి కాంపోనెంట్ ద్వారా వివరించబడిన వైవిధ్యాన్ని సూచిస్తాయి. d CZ మినహాయించి కణజాల స్థాయిలో GA సిగ్నల్, ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రత, మరియు ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ మధ్య స్పియర్‌మన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ. కుడి వైపున ఉన్న సంఖ్య రెండు వేరియబుల్స్ మధ్య స్పియర్‌మన్ రో విలువ. నక్షత్ర గుర్తులు సహసంబంధం/ప్రతికూల సహసంబంధం చాలా ముఖ్యమైన సందర్భాలను సూచిస్తాయి. e కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా Col-0 SAM L1 కణాల 3D విజువలైజేషన్. 10 గంటల వద్ద SAMలో (కానీ ప్రిమోర్డియంలో కాదు) ఏర్పడిన కొత్త కణ గోడలకు వాటి కోణ విలువలను బట్టి రంగులు వేయబడ్డాయి. కలర్ బార్ కుడి దిగువ మూలలో చూపబడింది. ఇన్సెట్ 0 గంటల వద్ద సంబంధిత 3D చిత్రాన్ని చూపుతుంది. ఈ ప్రయోగాన్ని ఇలాంటి ఫలితాలతో రెండుసార్లు పునరావృతం చేశారు. బాక్స్ ప్లాట్లు IPR మరియు నాన్-IPR Col-0 SAM (n = 10 స్వతంత్ర మొక్కలు) లలో కణ విభజన రేట్లను ప్రదర్శిస్తాయి. మధ్య గీత మధ్యస్థాన్ని చూపుతుంది, మరియు బాక్స్ సరిహద్దులు 25వ మరియు 75వ పర్సంటైల్‌లను సూచిస్తాయి. విస్కర్‌లు R సాఫ్ట్‌వేర్‌తో నిర్ణయించబడిన కనిష్ట మరియు గరిష్ట విలువలను సూచిస్తాయి. P విలువలు వెల్చ్ యొక్క టూ-టెయిల్డ్ t-టెస్ట్‌తో పొందబడ్డాయి. g, h (g) SAM కేంద్రం (తెల్లటి చుక్కల గీత) నుండి వ్యాసార్థ దిశలో కొత్త కణ గోడ (మెజెంటా) కోణాన్ని ఎలా కొలవాలో (కేవలం అల్పకోణ విలువలు, అనగా 0–90°, మాత్రమే పరిగణించబడతాయి), మరియు (h) మెరిస్టెమ్ లోపల పరిధీయ/పార్శ్వ మరియు వ్యాసార్థ దిశలను చూపే రేఖాచిత్రం. i వరుసగా SAM (ముదురు నీలం), IPR (మధ్యస్థ నీలం), మరియు నాన్-IPR (లేత నీలం) అంతటా కణ విభజన తలం విన్యాసం యొక్క పౌనఃపున్య హిస్టోగ్రామ్‌లు. P విలువలు ద్విముఖ కొల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్ష ద్వారా పొందబడ్డాయి. ఈ ప్రయోగం ఇలాంటి ఫలితాలతో రెండుసార్లు పునరావృతం చేయబడింది. j వరుసగా P3 (లేత ఆకుపచ్చ), P4 (మధ్యస్థ ఆకుపచ్చ), మరియు P5 (ముదురు ఆకుపచ్చ) చుట్టూ ఉన్న IPR యొక్క కణ విభజన తలం విన్యాసం యొక్క పౌనఃపున్య హిస్టోగ్రామ్‌లు. P విలువలు ద్విముఖ కొల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్ష ద్వారా పొందబడ్డాయి. ఈ ప్రయోగం ఇలాంటి ఫలితాలతో రెండుసార్లు పునరావృతం చేయబడింది.
అందువల్ల, మేము తదుపరి, అస్సే సమయంలో కొత్తగా ఏర్పడిన కణ గోడలను గుర్తించడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ మరియు కణ విభజన కార్యకలాపాల మధ్య సంబంధాన్ని పరిశోధించాము (Fig. 5e). ఈ విధానం కణ విభజన యొక్క తరచుదనాన్ని మరియు దిశను కొలవడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. ఆశ్చర్యకరంగా, IPR మరియు మిగిలిన SAM (నాన్-IPR, Fig. 5f) లలో కణ విభజనల తరచుదనం ఒకే విధంగా ఉందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది IPR మరియు నాన్-IPR కణాల మధ్య GA సిగ్నలింగ్‌లోని తేడాలు కణ విభజనను గణనీయంగా ప్రభావితం చేయవని సూచిస్తుంది. ఇది, మరియు GA సిగ్నలింగ్ మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ మధ్య ఉన్న సానుకూల సంబంధం, GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపం కణ విభజన తలం యొక్క దిశను ప్రభావితం చేయగలదా అని పరిగణించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించాయి. మెరిస్టెమ్ కేంద్రం మరియు కొత్త కణ గోడ కేంద్రాన్ని కలిపే వ్యాసార్థ అక్షానికి సాపేక్షంగా, కొత్త కణ గోడ యొక్క దిశను ఒక లఘుకోణంగా మేము కొలిచాము (పటం 5e-i). మరియు, వ్యాసార్థ అక్షానికి సాపేక్షంగా 90°కి దగ్గరగా ఉన్న కోణాలలో కణాలు విభజన చెందడానికి స్పష్టమైన ధోరణిని గమనించాము. అత్యధిక పౌనఃపున్యాలు 70–80° (23.28%) మరియు 80–90° (22.62%) వద్ద కనిపించాయి (పటం 5e,i), ఇవి పరిధీయ/అడ్డ దిశలో జరిగే కణ విభజనలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి (పటం 5h). ఈ కణ విభజన ప్రవర్తనకు GA సిగ్నలింగ్ యొక్క తోడ్పాటును పరిశీలించడానికి, మేము IPR మరియు నాన్-IPRలలో కణ విభజన పారామితులను విడివిడిగా విశ్లేషించాము (పటం 5i). IPR కణాలలో విభజన కోణ పంపిణీ, నాన్-IPR కణాలలో లేదా మొత్తం SAMలోని కణాలలో ఉన్నదానికంటే భిన్నంగా ఉందని మేము గమనించాము. IPR కణాలు పార్శ్వ/వృత్తాకార కణ విభజనలను, అనగా 70–80° మరియు 80–90° (వరుసగా 33.86% మరియు 30.71% నిష్పత్తులలో) అధిక నిష్పత్తిలో ప్రదర్శించాయి (పటం 5i). అందువల్ల, GA సిగ్నలింగ్ క్రియాశీలత మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపీ మధ్య ఉన్న సహసంబంధం వలె, అధిక GA సిగ్నలింగ్‌కు మరియు పరిధీయ దిశకు దగ్గరగా ఉన్న కణ విభజన తలం విన్యాసానికి మధ్య ఒక సంబంధం ఉందని మా పరిశీలనలు వెల్లడించాయి (పటం 5c, d). ఈ సంబంధం యొక్క ప్రాదేశిక పరిరక్షణను మరింతగా స్థాపించడానికి, మేము P3 నుండి ప్రారంభమయ్యే ప్రిమోర్డియం చుట్టూ ఉన్న IPR కణాలలో విభజన తలం విన్యాసాన్ని కొలిచాము, ఎందుకంటే P4 నుండి ప్రారంభమయ్యే ఈ ప్రాంతంలో అత్యధిక GA సిగ్నలింగ్ క్రియాశీలత కనుగొనబడింది (పటం 4). P3 మరియు P4 చుట్టూ ఉన్న IPR యొక్క విభజన కోణాలలో గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలు కనిపించలేదు, అయినప్పటికీ P4 చుట్టూ ఉన్న IPRలో పార్శ్వ కణ విభజనల పౌనఃపున్యం పెరిగినట్లు గమనించబడింది (పటం 5j). అయితే, P5 చుట్టూ ఉన్న IPR కణాలలో, కణ విభజన తలం యొక్క దిశలో వ్యత్యాసం గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా మారింది, అడ్డ కణ విభజనల పౌనఃపున్యంలో తీవ్రమైన పెరుగుదల కనిపించింది (Fig. 5j). ఈ ఫలితాలన్నీ కలిసి, GA సిగ్నలింగ్ SAMలో కణ విభజనల దిశను నియంత్రించగలదని సూచిస్తున్నాయి, ఇది అధిక GA సిగ్నలింగ్ IPRలో కణ విభజనల పార్శ్వ దిశను ప్రేరేపించగలదని తెలిపిన మునుపటి నివేదికలు40,41తో ఏకీభవిస్తుంది.
IPRలోని కణాలు ప్రిమోర్డియాలో కాకుండా ఇంటర్నోడ్స్‌లో చేర్చబడతాయని అంచనా వేయబడింది2,42,43. IPRలో కణ విభజనల యొక్క అడ్డ దిశ, ఇంటర్నోడ్స్‌లో బాహ్యచర్మ కణాల సమాంతర నిలువు వరుసల యొక్క సాధారణ అమరికకు దారితీయవచ్చు. పైన వివరించిన మా పరిశీలనలు, కణ విభజన దిశను నియంత్రించడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ ఈ ప్రక్రియలో పాత్ర పోషిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
అనేక DELLA జన్యువుల పనితీరు కోల్పోవడం నిరంతర GA ప్రతిస్పందనకు దారితీస్తుంది, మరియు ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి డెల్లా మ్యూటెంట్లను ఉపయోగించవచ్చు44. మేము మొదట SAMలో ఐదు DELLA జన్యువుల వ్యక్తీకరణ నమూనాలను విశ్లేషించాము. GUS లైన్45 యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ఫ్యూజన్ ద్వారా GAI, RGA, RGL1, మరియు RGL2 (చాలా తక్కువ స్థాయిలో) SAMలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయని వెల్లడైంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 11a–d). ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ ద్వారా GAI mRNA ప్రత్యేకంగా ప్రిమోర్డియా మరియు అభివృద్ధి చెందుతున్న పువ్వులలో పేరుకుపోతుందని మరింతగా నిరూపించబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 11e). RGL1 మరియు RGL3 mRNAలు SAM కానోపీ అంతటా మరియు పాత పువ్వులలో గుర్తించబడ్డాయి, అయితే RGL2 mRNA సరిహద్దు ప్రాంతంలో ఎక్కువగా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM యొక్క కాన్ఫోకల్ ఇమేజింగ్, ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ ద్వారా గమనించిన వ్యక్తీకరణను ధృవీకరించింది మరియు RGL3 ప్రోటీన్ SAM యొక్క మధ్య భాగంలో పేరుకుపోతుందని చూపించింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 11i). pRGA::GFP-RGA లైన్‌ను ఉపయోగించి, RGA ప్రోటీన్ SAMలో పేరుకుపోతుందని, కానీ P4 నుండి ప్రారంభమయ్యే సరిహద్దు వద్ద దాని సమృద్ధి తగ్గుతుందని కూడా మేము కనుగొన్నాము (అనుబంధ చిత్రం 11j). ముఖ్యంగా, qmRGA ద్వారా గుర్తించినట్లుగా (చిత్రం 4), RGL3 మరియు RGA యొక్క వ్యక్తీకరణ నమూనాలు IPRలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపానికి అనుగుణంగా ఉన్నాయి. అంతేకాకుండా, ఈ డేటా అన్ని DELLAలు SAMలో వ్యక్తీకరించబడతాయని మరియు వాటి వ్యక్తీకరణ సమిష్టిగా మొత్తం SAM అంతటా విస్తరించి ఉందని సూచిస్తుంది.
తరువాత మేము వైల్డ్-టైప్ SAM (లెర్, కంట్రోల్) మరియు gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 డెల్లా క్విన్టపుల్ (గ్లోబల్) మ్యూటెంట్లలో కణ విభజన పారామితులను విశ్లేషించాము (Fig. 6a, b). ఆసక్తికరంగా, వైల్డ్ టైప్‌తో పోలిస్తే డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ SAMలో కణ విభజన కోణాల పౌనఃపున్యాల పంపిణీలో గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన మార్పును మేము గమనించాము (Fig. 6c). డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్‌లో ఈ మార్పు 80–90° కోణాల పౌనఃపున్యం (34.71% vs. 24.55%) మరియు, కొంత తక్కువ స్థాయిలో, 70–80° కోణాల పౌనఃపున్యం (23.78% vs. 20.18%) పెరగడం వల్ల సంభవించింది, అనగా, ఇవి అడ్డ కణ విభజనలకు సంబంధించినవి (Fig. 6c). అడ్డ విభజనలు కాని వాటి (0–60°) పౌనఃపున్యం కూడా డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్‌లో తక్కువగా ఉంది (Fig. 6c). డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ యొక్క SAMలో అడ్డ కణ విభజనల పౌనఃపున్యం గణనీయంగా పెరిగింది (పటం 6b). వైల్డ్ టైప్‌తో పోలిస్తే డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్‌లో IPRలో కూడా అడ్డ కణ విభజనల పౌనఃపున్యం ఎక్కువగా ఉంది (పటం 6d). IPR ప్రాంతం వెలుపల, వైల్డ్ టైప్‌లో కణ విభజన కోణాల పంపిణీ మరింత ఏకరీతిగా ఉండగా, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ IPR లాగా స్పర్శరేఖీయ విభజనలను ఇష్టపడింది (పటం 6e). GA పేరుకుపోయే GA-క్రియారహిత మ్యూటెంట్ నేపథ్యమైన ga2 ఆక్సిడేస్ (ga2ox) క్వింటపుల్ మ్యూటెంట్ల (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, మరియు ga2ox6-2) SAMలో కణ విభజనల దిశను కూడా మేము లెక్కించాము. GA స్థాయిల పెరుగుదలకు అనుగుణంగా, క్వింటపుల్ ga2ox మ్యూటెంట్ పుష్పగుచ్ఛం యొక్క SAM, Col-0 కంటే పెద్దదిగా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 12a, b), మరియు Col-0తో పోల్చినప్పుడు, క్వింటపుల్ ga2ox SAM కణ విభజన కోణాల యొక్క స్పష్టంగా భిన్నమైన పంపిణీని చూపించింది, కోణ పౌనఃపున్యం 50° నుండి 90°కి పెరిగింది, అంటే మళ్ళీ స్పర్శరేఖీయ విభజనలకు అనుకూలంగా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 12a–c). అందువల్ల, GA సిగ్నలింగ్ యొక్క నిరంతర క్రియాశీలత మరియు GA చేరడం అనేవి IPR మరియు మిగిలిన SAMలో పార్శ్వ కణ విభజనలను ప్రేరేపిస్తాయని మేము చూపిస్తున్నాము.
a, b కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి PI-స్టెయిన్డ్ లెర్ (a) మరియు గ్లోబల్ డెల్లా మ్యూటెంట్ (b) SAM యొక్క L1 పొర యొక్క 3D విజువలైజేషన్. 10-గంటల వ్యవధిలో SAMలో (కానీ ప్రిమోర్డియంలో కాదు) ఏర్పడిన కొత్త కణ గోడలు వాటి కోణ విలువల ప్రకారం రంగులు వేయబడి చూపబడ్డాయి. ఇన్సెట్ 0 గంటల వద్ద SAMను చూపుతుంది. కలర్ బార్ దిగువ కుడి మూలలో ప్రదర్శించబడింది. (b)లోని బాణం గ్లోబల్ డెల్లా మ్యూటెంట్‌లో అమర్చబడిన కణ ఫైళ్ల ఉదాహరణను సూచిస్తుంది. ఈ ప్రయోగం ఇలాంటి ఫలితాలతో రెండుసార్లు పునరావృతం చేయబడింది. ce లెర్ మరియు గ్లోబల్ డెల్లా మధ్య మొత్తం SAM (d), IPR (e), మరియు నాన్-IPR (f)లలో కణ విభజన తలం విన్యాసాల ఫ్రీక్వెన్సీ పంపిణీ యొక్క పోలిక. P విలువలు టూ-టెయిల్డ్ కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్షను ఉపయోగించి పొందబడ్డాయి. f, g Col-0 (i) మరియు pCUC2::gai-1-VENUS (j) జన్యుమార్పిడి మొక్కల యొక్క PI-రంగు వేయబడిన SAM యొక్క కాన్ఫోకల్ చిత్రాల 3D దృశ్యీకరణ. ప్యానెల్లు (a, b) 10 గంటలలోపు SAMలో ఏర్పడిన కొత్త కణ గోడలను (కానీ ప్రిమోర్డియాను కాదు) చూపుతాయి. ఈ ప్రయోగాన్ని ఇలాంటి ఫలితాలతో రెండుసార్లు పునరావృతం చేశారు. h–j Col-0 మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కల మధ్య మొత్తం SAM (h), IPR (i) మరియు నాన్-IPR (j) లలో ఉన్న కణ విభజన తలం విన్యాసాల పౌనఃపున్య పంపిణీ యొక్క పోలిక. P విలువలను టూ-టెయిల్డ్ కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్షను ఉపయోగించి పొందారు.
తరువాత, మేము ప్రత్యేకంగా IPRలో GA సిగ్నలింగ్‌ను నిరోధించడం వల్ల కలిగే ప్రభావాన్ని పరీక్షించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మేము VENUSతో సంలీనం చేయబడిన ఒక డామినెంట్ నెగటివ్ gai-1 ప్రోటీన్ యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించడానికి కాటిలెడాన్ కప్ 2 (CUC2) ప్రమోటర్‌ను ఉపయోగించాము (pCUC2::gai-1-VENUS లైన్‌లో). వైల్డ్-టైప్ SAMలో, CUC2 ప్రమోటర్ P4 నుండి సరిహద్దు కణాలతో సహా SAMలోని చాలా IPRల వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుంది, మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కలలో కూడా ఇలాంటి నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ గమనించబడింది (క్రింద చూడండి). pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కల యొక్క SAM లేదా IPR అంతటా కణ విభజన కోణాల పంపిణీ వైల్డ్-టైప్‌తో పోలిస్తే గణనీయంగా భిన్నంగా లేదు, అయినప్పటికీ ఊహించని విధంగా ఈ మొక్కలలో IPR లేని కణాలు 80–90° అధిక పౌనఃపున్యంతో విభజన చెందడాన్ని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 6f–j).
కణ విభజన దిశ SAM యొక్క జ్యామితిపై, ముఖ్యంగా కణజాల వక్రత ద్వారా ఉత్పన్నమయ్యే తన్యత ఒత్తిడిపై ఆధారపడి ఉంటుందని సూచించబడింది46. అందువల్ల, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కలలో SAM ఆకారం మార్చబడిందా అని మేము పరిశీలించాము. గతంలో నివేదించినట్లుగా12, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ SAM పరిమాణం వైల్డ్ టైప్ కంటే పెద్దదిగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 13a, b, d). CLV3 మరియు STM RNA యొక్క ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ డెల్లా మ్యూటెంట్లలో మెరిస్టెమ్ విస్తరణను ధృవీకరించింది మరియు స్టెమ్ సెల్ నిచ్ యొక్క పార్శ్వ విస్తరణను కూడా చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 13e, f, h, i). అయితే, రెండు జన్యురకాలలోనూ SAM వక్రత ఒకే విధంగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 13k, m, n, p). వైల్డ్ టైప్‌తో పోల్చినప్పుడు, gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della క్వాడ్రపుల్ మ్యూటెంట్‌లో వక్రతలో మార్పు లేకుండా పరిమాణంలో ఇలాంటి పెరుగుదలను మేము గమనించాము (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13c, d, g, j, l, o, p). della క్వాడ్రపుల్ మ్యూటెంట్‌లో కణ విభజన దిశ యొక్క పౌనఃపున్యం కూడా ప్రభావితమైంది, కానీ della మోనోలిథిక్ మ్యూటెంట్ కంటే తక్కువ స్థాయిలో (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 12d–f). ఈ డోసేజ్ ప్రభావం, వక్రతపై ప్రభావం లేకపోవడంతో పాటు, Della క్వాడ్రపుల్ మ్యూటెంట్‌లో మిగిలి ఉన్న RGL3 క్రియాశీలత, DELLA క్రియాశీలత కోల్పోవడం వల్ల కలిగే కణ విభజన దిశలో మార్పులను పరిమితం చేస్తుందని మరియు పార్శ్వ కణ విభజనలలో మార్పులు SAM జ్యామితిలో మార్పులకు కాకుండా GA సిగ్నలింగ్ క్రియాశీలతలో మార్పులకు ప్రతిస్పందనగా సంభవిస్తాయని సూచిస్తుంది. పైన వివరించినట్లుగా, CUC2 ప్రమోటర్ P4 నుండి SAMలో IPR వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుంది (అనుబంధ చిత్రం 14a, b), మరియు దీనికి విరుద్ధంగా, pCUC2::gai-1-VENUS SAM పరిమాణం తగ్గినా, వక్రత ఎక్కువగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM స్వరూపంలో ఈ మార్పు, వైల్డ్ టైప్‌తో పోలిస్తే యాంత్రిక ఒత్తిడుల పంపిణీలో తేడాకు దారితీయవచ్చు, వైల్డ్ టైప్‌లో అధిక పరిధీయ ఒత్తిడులు SAM కేంద్రం నుండి తక్కువ దూరంలోనే ప్రారంభమవుతాయి47. ప్రత్యామ్నాయంగా, pCUC2::gai-1-VENUS SAM స్వరూపంలో మార్పులు ట్రాన్స్‌జీన్ వ్యక్తీకరణ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ప్రాంతీయ యాంత్రిక లక్షణాలలో మార్పుల వల్ల కూడా సంభవించవచ్చు48. ఈ రెండు సందర్భాలలో, కణాలు పరిధీయ/అడ్డ దిశలో విభజన చెందే సంభావ్యతను పెంచడం ద్వారా, ఇది GA సిగ్నలింగ్‌లోని మార్పుల ప్రభావాలను పాక్షికంగా భర్తీ చేయగలదు, తద్వారా మా పరిశీలనలను వివరిస్తుంది.
మొత్తంగా చూస్తే, IPRలో కణ విభజన తలం యొక్క పార్శ్వ దిశలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ చురుకైన పాత్ర పోషిస్తుందని మా డేటా నిర్ధారిస్తుంది. అలాగే, మెరిస్టెమ్ వంపు కూడా IPRలో కణ విభజన తలం యొక్క దిశను ప్రభావితం చేస్తుందని అవి చూపిస్తున్నాయి.
అధిక GA సిగ్నలింగ్ క్రియాశీలత కారణంగా IPRలో విభజన తలం యొక్క అడ్డ అమరిక, తరువాత ఎపిడెర్మల్ ఇంటర్నోడ్‌లో కనిపించే కణ నిర్మాణాన్ని నిర్వచించడానికి, GA అనేది SAM లోపల ఎపిడెర్మిస్‌లో ఒక రేడియల్ కణ వరుసను ముందుగానే ఏర్పాటు చేస్తుందని సూచిస్తుంది. నిజానికి, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ల యొక్క SAM చిత్రాలలో అటువంటి కణ వరుసలు తరచుగా కనిపించాయి (Fig. 6b). అందువల్ల, SAMలో GA సిగ్నలింగ్ యొక్క ప్రాదేశిక నమూనా యొక్క అభివృద్ధి సంబంధిత విధిని మరింతగా అన్వేషించడానికి, మేము వైల్డ్-టైప్ (లెర్ మరియు కోల్-0), డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్లు, మరియు pCUC2::gai-1-VENUS ట్రాన్స్‌జెనిక్ మొక్కలలోని IPRలో కణాల ప్రాదేశిక నిర్మాణాన్ని విశ్లేషించడానికి టైమ్-లాప్స్ ఇమేజింగ్‌ను ఉపయోగించాము.
qmRGA ద్వారా IPRలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపం P1/P2 నుండి పెరిగి P4 వద్ద గరిష్ట స్థాయికి చేరుకుందని, మరియు ఈ నమూనా కాలక్రమేణా స్థిరంగా ఉందని మేము కనుగొన్నాము (Fig. 4a–f మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 8c–f, k). పెరుగుతున్న GA సిగ్నల్‌తో IPRలోని కణాల ప్రాదేశిక అమరికను విశ్లేషించడానికి, మేము మొదటి పరిశీలన తర్వాత 34 గంటలకు, అంటే రెండు ప్లాస్టిడ్ సమయాల కంటే ఎక్కువ, విశ్లేషించిన వాటి అభివృద్ధి దశ ప్రకారం P4 పైన మరియు ప్రక్కల ఉన్న Ler IPR కణాలకు లేబుల్ చేసాము. ఇది P1/P2 నుండి P4 వరకు ప్రిమోర్డియం అభివృద్ధి సమయంలో IPR కణాలను అనుసరించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. మేము మూడు వేర్వేరు రంగులను ఉపయోగించాము: P4 సమీపంలో ప్రిమోర్డియంలో కలిసిపోయిన కణాలకు పసుపు, IPRలో ఉన్న వాటికి ఆకుపచ్చ, మరియు రెండు ప్రక్రియలలో పాల్గొన్న వాటికి ఊదా రంగు (Fig. 7a–c). t0 (0 గంటలు) వద్ద, P4 ముందు 1–2 పొరల IPR కణాలు కనిపించాయి (Fig. 7a). ఊహించినట్లుగానే, ఈ కణాలు విభజన చెందినప్పుడు, అవి ప్రధానంగా అడ్డ విభజన తలం ద్వారా విభజన చెందాయి (పటాలు 7a–c). Col-0 SAMను ఉపయోగించినప్పుడు కూడా ఇలాంటి ఫలితాలే వచ్చాయి (లెర్‌లోని P4 మాదిరిగానే అంచు మడతపడే P3పై దృష్టి సారించినప్పుడు), అయినప్పటికీ ఈ జన్యురకంలో పుష్ప అంచు వద్ద ఏర్పడిన మడత IPR కణాలను మరింత త్వరగా కప్పివేసింది (పటాలు 7g–i). అందువల్ల, IPR కణాల విభజన సరళి, కణుపుల మధ్య ఉండే విధంగానే, కణాలను వ్యాసార్థ వరుసలుగా ముందుగానే అమరుస్తుంది. వ్యాసార్థ వరుసల అమరిక మరియు వరుస అవయవాల మధ్య IPR కణాలు కేంద్రీకృతమై ఉండటం, ఈ కణాలు కణుపుల మధ్య పూర్వకణాలని సూచిస్తున్నాయి.
ఇక్కడ, మేము ఒక రేషియోమెట్రిక్ GA సిగ్నలింగ్ బయోసెన్సార్ అయిన qmRGAను అభివృద్ధి చేశాము. ఇది అంతర్గత సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో జోక్యాన్ని తగ్గిస్తూ, GA మరియు GA గ్రాహకాల సాంద్రతల కలయిక ఫలితంగా ఏర్పడే GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాన్ని పరిమాణాత్మకంగా మ్యాపింగ్ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది, తద్వారా కణ స్థాయిలో GA పనితీరుపై సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. ఈ లక్ష్యంతో, మేము ఒక సవరించిన DELLA ప్రోటీన్ అయిన mRGAను నిర్మించాము. ఇది DELLA ఇంటరాక్షన్ భాగస్వాములతో బంధించే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోయినప్పటికీ, GA-ప్రేరిత ప్రోటియోలైసిస్‌కు సున్నితంగా ఉంటుంది. qmRGA, GA స్థాయిలలోని బాహ్య మరియు అంతర్గత మార్పులకు రెండింటికీ ప్రతిస్పందిస్తుంది, మరియు దాని డైనమిక్ సెన్సింగ్ లక్షణాలు అభివృద్ధి సమయంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపంలో దేశకాలిక మార్పులను అంచనా వేయడానికి వీలు కల్పిస్తాయి. qmRGA చాలా అనువైన సాధనం కూడా, ఎందుకంటే దాని వ్యక్తీకరణ కోసం ఉపయోగించే ప్రమోటర్‌ను మార్చడం ద్వారా (అవసరమైతే) దీనిని వివిధ కణజాలాలకు అనుగుణంగా మార్చవచ్చు, మరియు ఆంజియోస్పెర్మ్‌లలో GA సిగ్నలింగ్ మార్గం మరియు PFYRE మోటిఫ్ యొక్క సంరక్షిత స్వభావాన్ని బట్టి, దీనిని ఇతర జాతులకు కూడా బదిలీ చేసే అవకాశం ఉంది22. దీనికి అనుగుణంగా, వరి SLR1 DELLA ప్రోటీన్‌లోని ఒక సమానమైన మ్యుటేషన్ (HYY497AAA) కూడా, mRGA23 మాదిరిగానే, SLR1 యొక్క పెరుగుదలను అణచివేసే చర్యను అణచివేస్తుందని, అదే సమయంలో దాని GA-మధ్యవర్తిత్వ క్షీణతను స్వల్పంగా మాత్రమే తగ్గిస్తుందని చూపబడింది. ముఖ్యంగా, అరాబిడోప్సిస్‌లో ఇటీవలి అధ్యయనాలు, PFYRE డొమైన్‌లోని ఒకే అమైనో ఆమ్ల మ్యుటేషన్ (S474L), ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ భాగస్వాములతో సంకర్షణ చెందే దాని సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేయకుండానే RGA యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ చర్యను మార్చిందని చూపించాయి50. ఈ మ్యుటేషన్ mRGAలో ఉన్న 3 అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలకు చాలా దగ్గరగా ఉన్నప్పటికీ, ఈ రెండు మ్యుటేషన్‌లు DELLA యొక్క విభిన్న లక్షణాలను మారుస్తాయని మా అధ్యయనాలు చూపిస్తున్నాయి. చాలా ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ భాగస్వాములు DELLA26,51 యొక్క LHR1 మరియు SAW డొమైన్‌లకు బంధించినప్పటికీ, PFYRE డొమైన్‌లోని కొన్ని సంరక్షించబడిన అమైనో ఆమ్లాలు ఈ పరస్పర చర్యలను స్థిరీకరించడంలో సహాయపడవచ్చు.
మొక్కల నిర్మాణంలో మరియు దిగుబడి మెరుగుదలలో కణుపుల మధ్య అభివృద్ధి ఒక ముఖ్యమైన లక్షణం. qmRGA, IPR కణుపుల మధ్య పూర్వకణాలలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను వెల్లడించింది. పరిమాణాత్మక ఇమేజింగ్ మరియు జన్యుశాస్త్రాన్ని కలపడం ద్వారా, GA సిగ్నలింగ్ నమూనాలు SAM బాహ్యచర్మంలోని వృత్తాకార/అడ్డ కణ విభజన తలాలపై అతివ్యాప్తి చెంది, కణుపుల మధ్య అభివృద్ధికి అవసరమైన కణ విభజన వ్యవస్థను రూపొందిస్తాయని మేము చూపించాము. అభివృద్ధి సమయంలో కణ విభజన తలం యొక్క దిశను నియంత్రించే అనేక నియంత్రకాలు గుర్తించబడ్డాయి52,53. GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ ఈ కణ పరామితిని ఎలా నియంత్రిస్తుందో మా పరిశోధన ఒక స్పష్టమైన ఉదాహరణను అందిస్తుంది. DELLA, ప్రీఫోల్డింగ్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లతో సంకర్షణ చెందగలదు41, కాబట్టి GA సిగ్నలింగ్, కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ దిశను నేరుగా ప్రభావితం చేయడం ద్వారా కణ విభజన తలం యొక్క దిశను నియంత్రించవచ్చు40,41,54,55. SAMలో, అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణకు సంబంధించిన అంశం కణాల పొడవు పెరగడం లేదా విభజన కాదని, కేవలం పెరుగుదల అసమానత మాత్రమేనని మేము ఊహించని విధంగా చూపించాము. ఇది IPRలో కణ విభజన దిశపై GA యొక్క ప్రత్యక్ష ప్రభావానికి అనుగుణంగా ఉంది. అయినప్పటికీ, ఈ ప్రభావం పరోక్షంగా కూడా ఉండవచ్చనే విషయాన్ని మేము తోసిపుచ్చలేము, ఉదాహరణకు GA-ప్రేరిత కణ గోడ మెత్తబడటం ద్వారా ఇది జరగవచ్చు56. కణ గోడ లక్షణాలలో మార్పులు యాంత్రిక ఒత్తిడిని ప్రేరేపిస్తాయి57,58, ఇది కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క దిశను ప్రభావితం చేయడం ద్వారా కణ విభజన తలం యొక్క దిశను కూడా ప్రభావితం చేస్తుంది39,46,59. GA-ప్రేరిత యాంత్రిక ఒత్తిడి మరియు GA ద్వారా మైక్రోట్యూబ్యూల్ దిశ యొక్క ప్రత్యక్ష నియంత్రణ యొక్క సంయుక్త ప్రభావాలు, ఇంటర్నోడ్లను నిర్వచించడానికి IPRలో కణ విభజన దిశ యొక్క ఒక నిర్దిష్ట నమూనాను రూపొందించడంలో పాలుపంచుకోవచ్చు, మరియు ఈ ఆలోచనను పరీక్షించడానికి మరిన్ని అధ్యయనాలు అవసరం. అదేవిధంగా, మునుపటి అధ్యయనాలు ఇంటర్నోడ్ నిర్మాణం యొక్క నియంత్రణలో DELLA-తో సంకర్షణ చెందే ప్రోటీన్లు TCP14 మరియు 15 యొక్క ప్రాముఖ్యతను నొక్కిచెప్పాయి60,61 మరియు ఈ కారకాలు, ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధిని నియంత్రించే మరియు GA సిగ్నలింగ్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయని చూపబడిన BREVIPEDICELLUS (BP) మరియు PENNYWISE (PNY) లతో కలిసి GA యొక్క చర్యకు మధ్యవర్తిత్వం వహించవచ్చు2,62. డెల్లాలు బ్రాసినోస్టెరాయిడ్, ఇథిలీన్, జాస్మోనిక్ ఆమ్లం మరియు అబ్సిసిక్ ఆమ్లం (ABA) సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో సంకర్షణ చెందుతాయి63,64 మరియు ఈ హార్మోన్లు మైక్రోట్యూబ్యూల్ ధోరణిని ప్రభావితం చేయగలవు65 కాబట్టి, కణ విభజన ధోరణిపై GA యొక్క ప్రభావాలు ఇతర హార్మోన్ల ద్వారా కూడా మధ్యవర్తిత్వం వహించవచ్చు.
ప్రారంభ కణశాస్త్ర అధ్యయనాలు అరాబిడోప్సిస్ SAM యొక్క లోపలి మరియు బయటి ప్రాంతాలు రెండూ ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధికి అవసరమని చూపించాయి2,42. లోపలి కణజాలాలలో GA కణ విభజనను చురుకుగా నియంత్రిస్తుందనే వాస్తవం12, SAMలో మెరిస్టెమ్ మరియు ఇంటర్నోడ్ పరిమాణాన్ని నియంత్రించడంలో GA యొక్క ద్వంద్వ విధికి మద్దతు ఇస్తుంది. లోపలి SAM కణజాలంలో దిశాత్మక కణ విభజన నమూనా కూడా కఠినంగా నియంత్రించబడుతుంది, మరియు ఈ నియంత్రణ కాండం పెరుగుదలకు అత్యవసరం52. లోపలి SAM వ్యవస్థలో కణ విభజన తలాన్ని నిర్దేశించడంలో GA కూడా పాత్ర పోషిస్తుందో లేదో పరిశీలించడం ఆసక్తికరంగా ఉంటుంది, తద్వారా SAM లోపల ఇంటర్నోడ్ల నిర్దిష్టత మరియు అభివృద్ధిని సమకాలీకరిస్తుంది.
హైపోకోటిల్ మరియు వేరు పెరుగుదల ప్రయోగాలలో మినహా, మొక్కలను ప్రామాణిక పరిస్థితులలో (16 గంటల కాంతి, 22 °C) మట్టిలో లేదా 1% సుక్రోజ్ మరియు 1% అగర్ (సిగ్మా) కలిపిన 1x మురాషిగే-స్కోగ్ (MS) మీడియం (డూచెఫా)లో ఇన్ విట్రో పద్ధతిలో పెంచారు. హైపోకోటిల్ మరియు వేరు పెరుగుదల ప్రయోగాలలో మొలకలను నిరంతర కాంతి మరియు 22 °C వద్ద నిలువు ప్లేట్లపై పెంచారు. నైట్రేట్ ప్రయోగాల కోసం, మొక్కలను దీర్ఘ-కాల పగటి పరిస్థితులలో తగినంత నైట్రేట్ (0 లేదా 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-సక్సినేట్, 1% సుక్రోజ్ మరియు 1% A-అగర్ (సిగ్మా) కలిపిన సవరించిన MS మీడియం (బయోవరల్డ్ ప్లాంట్ మీడియం)లో పెంచారు.
pDONR221 లోకి చొప్పించిన GID1a cDNAను, pDONR P4-P1R-pUBQ10 మరియు pDONR P2R-P3-mCherry లతో pB7m34GW లోకి పునఃసంయోగం చేసి pUBQ10::GID1a-mCherry ను రూపొందించారు. pDONR221 లోకి చొప్పించిన IDD2 DNAను, pB7RWG266 లోకి పునఃసంయోగం చేసి p35S:IDD2-RFP ను రూపొందించారు. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, GID1b కోడింగ్ ప్రాంతానికి ముందున్న 3.9 kb ఖండాన్ని మరియు GID1b cDNA (1.3 kb) మరియు టెర్మినేటర్ (3.4 kb) లను కలిగి ఉన్న 4.7 kb ఖండాన్ని మొదట అనుబంధ పట్టిక 3లోని ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి విస్తరించారు. ఆ తర్వాత వాటిని వరుసగా pDONR P4-P1R (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు pDONR P2R-P3 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లలోకి చొప్పించి, చివరగా గేట్‌వే క్లోనింగ్‌ను ఉపయోగించి pDONR221 2xmTQ268 తో pGreen 012567 టార్గెట్ వెక్టర్‌లోకి పునఃసంయోగం చేశారు. pCUC2::LSSmOrangeను రూపొందించడానికి, CUC2 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ (ATGకి 3229 bp ఎగువన), దాని తర్వాత N7 న్యూక్లియర్ లోకలైజేషన్ సిగ్నల్ మరియు NOS ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ టెర్మినేటర్‌తో కూడిన లార్జ్ స్టోక్స్-షిఫ్టెడ్ mOrange (LSSmOrange)69 యొక్క కోడింగ్ సీక్వెన్స్‌ను గేట్‌వే 3-ఫ్రాగ్మెంట్ రీకాంబినేషన్ సిస్టమ్ (ఇన్విట్రోజెన్) ఉపయోగించి pGreen కనామైసిన్ టార్గెటింగ్ వెక్టర్‌లోకి సమీకరించారు. ఈ ప్లాంట్ బైనరీ వెక్టర్‌ను వరుసగా అగ్రోబాక్టీరియం ఇన్‌ఫిల్ట్రేషన్ పద్ధతి ద్వారా అగ్రోబాక్టీరియం ట్యూమెఫేసియన్స్ స్ట్రెయిన్ GV3101లోకి మరియు నికోటియానా బెంథమియానా ఆకులలోకి, మరియు ఫ్లోరల్ డిప్ పద్ధతి ద్వారా అరాబిడోప్సిస్ థాలియానా Col-0లోకి ప్రవేశపెట్టారు. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry మరియు pCLV3::mCherry-NLS qmRGAలను వరుసగా ఆయా క్రాస్‌ల యొక్క F3 మరియు F1 సంతతుల నుండి వేరు చేశారు.
సుమారు 1 సెం.మీ. పొడవున్న చిగురు కొనల⁷² మీద RNA ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ నిర్వహించబడింది. వీటిని సేకరించి, 4 °C కు ముందుగా చల్లబరిచిన FAA ద్రావణంలో (3.7% ఫార్మాల్డిహైడ్, 5% ఎసిటిక్ ఆమ్లం, 50% ఇథనాల్) వెంటనే స్థిరీకరించారు. 2 × 15 నిమిషాల వాక్యూమ్ చికిత్సల తర్వాత, స్థిరీకరణ ద్రావణాన్ని మార్చి, నమూనాలను రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేశారు. రోసియర్ మరియు ఇతరులు⁷³ వివరించిన విధంగా, అనుబంధ పట్టిక 3లో చూపిన ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, మరియు RGL3 cDNAలు మరియు వాటి 3′-UTRలకు యాంటీసెన్స్ ప్రోబ్‌లను సంశ్లేషణ చేశారు. డిగాక్సిజెనిన్-లేబుల్ చేయబడిన ప్రోబ్‌లను డిగాక్సిజెనిన్ యాంటీబాడీలను (3000-రెట్ల పలుచన; రోష్, కేటలాగ్ నంబర్: 11 093 274 910) ఉపయోగించి ఇమ్యునోడిటెక్ట్ చేశారు, మరియు సెక్షన్‌లకు 5-బ్రోమో-4-క్లోరో-3-ఇండోలిల్ ఫాస్ఫేట్ (BCIP, 250-రెట్ల పలుచన)/నైట్రోబ్లూ టెట్రాజోలియం (NBT, 200-రెట్ల పలుచన) ద్రావణంతో రంగు వేశారు.