షూట్ ఎపికల్ మెరిస్టెమ్‌లో ఇంటర్నోడ్ స్పెసిఫికేషన్‌లో గిబ్బరెల్లిన్‌ల పాత్రను క్వాంటిటేటివ్ గిబ్బరెల్లిన్ బయోసెన్సర్ వెల్లడిస్తుంది.

కాండం నిర్మాణానికి షూట్ ఎపికల్ మెరిస్టెమ్ (SAM) పెరుగుదల చాలా కీలకం. మొక్కల హార్మోన్లుగిబ్బరెల్లిన్స్(GAలు) మొక్కల పెరుగుదలను సమన్వయం చేయడంలో కీలక పాత్ర పోషిస్తాయి, కానీ SAMలో వాటి పాత్రను ఇంకా సరిగా అర్థం చేసుకోలేదు. ఇక్కడ, GA గుర్తింపుపై దాని క్షీణతను కాపాడుతూ, GA ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ ప్రతిస్పందనలో దాని ముఖ్యమైన నియంత్రణ పనితీరును అణిచివేసేందుకు DELLA ప్రోటీన్‌ను ఇంజనీరింగ్ చేయడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ యొక్క రేషియోమెట్రిక్ బయోసెన్సర్‌ను మేము అభివృద్ధి చేసాము. ఈ క్షీణత-ఆధారిత బయోసెన్సర్ అభివృద్ధి సమయంలో GA స్థాయిలు మరియు సెల్యులార్ సెన్సింగ్‌లో మార్పులను ఖచ్చితంగా నమోదు చేస్తుందని మేము ప్రదర్శిస్తాము. SAMలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను మ్యాప్ చేయడానికి మేము ఈ బయోసెన్సర్‌ను ఉపయోగించాము. ఇంటర్నోడ్ కణాలకు పూర్వగాములు అయిన ఆర్గాన్ ప్రిమోర్డియా మధ్య ఉన్న కణాలలో అధిక GA సిగ్నల్‌లు ప్రధానంగా ఉన్నాయని మేము చూపిస్తాము. లాభం మరియు పనితీరు నష్ట విధానాలను ఉపయోగించి, GA కణ విభజన విమానం యొక్క విన్యాసాన్ని నియంత్రిస్తుందని, ఇంటర్నోడ్‌ల యొక్క కానానికల్ సెల్యులార్ ఆర్గనైజేషన్‌ను ఏర్పాటు చేస్తుందని, తద్వారా SAMలో ఇంటర్నోడ్ స్పెసిఫికేషన్‌ను ప్రోత్సహిస్తుందని మేము మరింత ప్రదర్శిస్తాము.
షూట్ అపెక్స్ వద్ద ఉన్న షూట్ ఎపికల్ మెరిస్టెమ్ (SAM), మొక్క జీవితాంతం పార్శ్వ అవయవాలు మరియు కాండం నోడ్‌లను ఉత్పత్తి చేసే కార్యకలాపాలను కలిగి ఉన్న మూల కణాల సముదాయాన్ని కలిగి ఉంటుంది. ఈ పునరావృత యూనిట్లు లేదా మొక్కల నోడ్‌లలో, నోడ్‌ల వద్ద ఇంటర్నోడ్‌లు మరియు పార్శ్వ అవయవాలు మరియు ఆకు కక్ష్యలలో ఆక్సిలరీ మెరిస్టెమ్‌లు ఉంటాయి1. అభివృద్ధి సమయంలో మొక్కల నోడ్‌ల పెరుగుదల మరియు వ్యవస్థీకరణ మారుతుంది. అరబిడోప్సిస్‌లో, ఏపుగా ఉండే దశలో ఇంటర్నోడల్ పెరుగుదల అణచివేయబడుతుంది మరియు రోసెట్టే ఆకుల కక్ష్యలలో ఆక్సిలరీ మెరిస్టెమ్‌లు నిద్రాణంగా ఉంటాయి. పుష్ప దశకు పరివర్తన సమయంలో, SAM పుష్పగుచ్ఛ మెరిస్టెమ్‌గా మారుతుంది, పొడుగుచేసిన ఇంటర్నోడ్‌లు మరియు ఆక్సిలరీ మొగ్గలు, కాలిన్ ఆకుల కక్ష్యలలో శాఖలు మరియు తరువాత, ఆకులేని పువ్వులను ఉత్పత్తి చేస్తుంది2. ఆకులు, పువ్వులు మరియు కొమ్మల ప్రారంభాన్ని నియంత్రించే విధానాలను అర్థం చేసుకోవడంలో మనం గణనీయమైన పురోగతి సాధించినప్పటికీ, ఇంటర్నోడ్‌లు ఎలా ఉత్పన్నమవుతాయనే దాని గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.
GA ల యొక్క స్పాటియోటెంపోరల్ పంపిణీని అర్థం చేసుకోవడం వలన వివిధ కణజాలాలలో మరియు వివిధ అభివృద్ధి దశలలో ఈ హార్మోన్ల పనితీరు బాగా అర్థం అవుతుంది. దాని స్వంత ప్రమోటర్ చర్య కింద వ్యక్తీకరించబడిన RGA-GFP కలయిక యొక్క క్షీణత యొక్క దృశ్యమానత మూలాలలో మొత్తం GA స్థాయిల నియంత్రణపై ముఖ్యమైన సమాచారాన్ని అందిస్తుంది15,16. అయితే, RGA వ్యక్తీకరణ కణజాలాలలో మారుతూ ఉంటుంది17 మరియు GA18 ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది. అందువల్ల, RGA ప్రమోటర్ యొక్క అవకలన వ్యక్తీకరణ RGA-GFP తో గమనించిన ఫ్లోరోసెన్స్ నమూనాకు దారితీయవచ్చు మరియు అందువల్ల ఈ పద్ధతి పరిమాణాత్మకంగా ఉండదు. ఇటీవల, బయోయాక్టివ్ ఫ్లోరోసెసిన్ (Fl)-లేబుల్ చేయబడిన GA19,20 రూట్ ఎండోకార్టెక్స్‌లో GA చేరడం మరియు GA రవాణా ద్వారా దాని సెల్యులార్ స్థాయిల నియంత్రణను వెల్లడించింది. ఇటీవల, GA FRET సెన్సార్ nlsGPS1 GA స్థాయిలు మూలాలు, తంతువులు మరియు ముదురు-పెరిగిన హైపోకోటైల్స్‌లో సెల్ పొడిగింపుతో పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది21. అయితే, మనం చూసినట్లుగా, GA ఏకాగ్రత GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను నియంత్రించే ఏకైక పరామితి కాదు, ఎందుకంటే ఇది సంక్లిష్ట సెన్సింగ్ ప్రక్రియలపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఇక్కడ, DELLA మరియు GA సిగ్నలింగ్ మార్గాలపై మా అవగాహన ఆధారంగా, GA సిగ్నలింగ్ కోసం క్షీణత-ఆధారిత రేషియోమెట్రిక్ బయోసెన్సర్ యొక్క అభివృద్ధి మరియు లక్షణాలను మేము నివేదిస్తాము. ఈ పరిమాణాత్మక బయోసెన్సర్‌ను అభివృద్ధి చేయడానికి, మేము ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌తో అనుసంధానించబడి, కణజాలాలలో సర్వవ్యాప్తంగా వ్యక్తీకరించబడిన ఉత్పరివర్తన GA-సెన్సిటివ్ RGAని, అలాగే GA-ఇన్‌సెన్సిటివ్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌ను ఉపయోగించాము. ఉత్పరివర్తన RGA ప్రోటీన్ ఫ్యూజన్లు సర్వవ్యాప్తంగా వ్యక్తీకరించబడినప్పుడు ఎండోజెనస్ GA సిగ్నలింగ్‌తో జోక్యం చేసుకోవని మరియు ఈ బయోసెన్సర్ అధిక స్పాటియోటెంపోరల్ రిజల్యూషన్‌తో సెన్సింగ్ ఉపకరణం ద్వారా GA ఇన్‌పుట్ మరియు GA సిగ్నల్ ప్రాసెసింగ్ రెండింటి నుండి వచ్చే సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను లెక్కించగలదని మేము చూపిస్తాము. GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క స్పాటియోటెంపోరల్ పంపిణీని మ్యాప్ చేయడానికి మరియు SAM బాహ్యచర్మంలో GA సెల్యులార్ ప్రవర్తనను ఎలా నియంత్రిస్తుందో లెక్కించడానికి మేము ఈ బయోసెన్సర్‌ను ఉపయోగించాము. ఆర్గాన్ ప్రిమోర్డియా మధ్య ఉన్న SAM కణాల విభజన విమానం యొక్క విన్యాసాన్ని GA నియంత్రిస్తుందని, తద్వారా ఇంటర్నోడ్ యొక్క కానానికల్ సెల్యులార్ ఆర్గనైజేషన్‌ను నిర్వచిస్తుందని మేము ప్రదర్శిస్తాము.
చివరగా, పెరుగుతున్న హైపోకోటైల్స్‌ను ఉపయోగించి qmRGA ఎండోజెనస్ GA స్థాయిలలో మార్పులను నివేదించగలదా అని మేము అడిగాము. GA సంశ్లేషణను పెంచడం ద్వారా మరియు DELLA34 క్షీణతను పెంచడం ద్వారా నైట్రేట్ పెరుగుదలను ప్రేరేపిస్తుందని మేము గతంలో చూపించాము. దీని ప్రకారం, సమృద్ధిగా నైట్రేట్ సరఫరా (10 mM NO3−) కింద పెరిగిన pUBQ10::qmRGA మొలకలలోని హైపోకోటైల్ పొడవు నైట్రేట్-లోప పరిస్థితులలో పెరిగిన మొలకల కంటే గణనీయంగా ఎక్కువగా ఉందని మేము గమనించాము (అనుబంధ చిత్రం 6a). పెరుగుదల ప్రతిస్పందనకు అనుగుణంగా, నైట్రేట్ లేనప్పుడు పెరిగిన మొలకల కంటే 10 mM NO3− పరిస్థితులలో పెరిగిన మొలకల హైపోకోటైల్స్‌లో GA సంకేతాలు ఎక్కువగా ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 6b, c). అందువల్ల, qmRGA GA సాంద్రతలో ఎండోజెనస్ మార్పుల ద్వారా ప్రేరేపించబడిన GA సిగ్నలింగ్‌లో మార్పులను పర్యవేక్షించడాన్ని కూడా అనుమతిస్తుంది.
సెన్సార్ డిజైన్ ఆధారంగా ఊహించినట్లుగా, qmRGA ద్వారా కనుగొనబడిన GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ GA గాఢత మరియు GA అవగాహనపై ఆధారపడి ఉందో లేదో అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము వృక్షసంబంధమైన మరియు పునరుత్పత్తి కణజాలాలలో మూడు GID1 గ్రాహకాల వ్యక్తీకరణను విశ్లేషించాము. మొలకలలో, GID1-GUS రిపోర్టర్ లైన్ GID1a మరియు c లు కోటిలిడాన్‌లలో ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడ్డాయని చూపించింది (Fig. 3a–c). అదనంగా, మూడు గ్రాహకాలు ఆకులు, పార్శ్వ రూట్ ప్రిమోర్డియా, రూట్ టిప్స్ (GID1b యొక్క రూట్ క్యాప్ మినహా) మరియు వాస్కులర్ సిస్టమ్ (Fig. 3a–c)లలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి. పుష్పగుచ్ఛము SAMలో, మేము GID1b మరియు 1c కోసం మాత్రమే GUS సంకేతాలను గుర్తించాము (అనుబంధ చిత్రం 7a–c). ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ ఈ వ్యక్తీకరణ నమూనాలను నిర్ధారించింది మరియు SAMలో తక్కువ స్థాయిలలో GID1c ఏకరీతిలో వ్యక్తీకరించబడిందని మరింత నిరూపించింది, అయితే GID1b SAM అంచున అధిక వ్యక్తీకరణను చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b అనువాద సంలీనం కూడా GID1b వ్యక్తీకరణ యొక్క గ్రేడెడ్ పరిధిని వెల్లడించింది, SAM మధ్యలో తక్కువ లేదా వ్యక్తీకరణ లేని వ్యక్తీకరణ నుండి అవయవ సరిహద్దుల వద్ద అధిక వ్యక్తీకరణ వరకు (అనుబంధ చిత్రం 7m). అందువల్ల, GID1 గ్రాహకాలు కణజాలాలలో మరియు లోపల ఏకరీతిలో పంపిణీ చేయబడవు. తదుపరి ప్రయోగాలలో, GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) యొక్క అతిగా వ్యక్తీకరణ హైపోకోటైల్స్‌లో qmRGA యొక్క సున్నితత్వాన్ని బాహ్య GA అప్లికేషన్‌కు పెంచిందని కూడా మేము గమనించాము (చిత్రం 3d, e). దీనికి విరుద్ధంగా, హైపోకోటైల్‌లో qd17mRGA ద్వారా కొలవబడిన ఫ్లోరోసెన్స్ GA3 చికిత్సకు సున్నితంగా లేదు (చిత్రం 3f, g). రెండు పరీక్షల కోసం, సెన్సార్ యొక్క వేగవంతమైన ప్రవర్తనను అంచనా వేయడానికి మొలకలను GA (100 μM GA3) యొక్క అధిక సాంద్రతలతో చికిత్స చేశారు, ఇక్కడ GID1 గ్రాహకానికి బంధించే సామర్థ్యం మెరుగుపడింది లేదా కోల్పోయింది. ఈ ఫలితాలు కలిసి, qmRGA బయోసెన్సర్ GA మరియు GA సెన్సార్‌గా మిశ్రమ ఫంక్షన్‌ను అందిస్తుందని నిర్ధారిస్తుంది మరియు GID1 రిసెప్టర్ యొక్క అవకలన వ్యక్తీకరణ సెన్సార్ యొక్క ఉద్గారతను గణనీయంగా మాడ్యులేట్ చేయగలదని సూచిస్తుంది.
నేటి వరకు, SAMలో GA సిగ్నల్‌ల పంపిణీ అస్పష్టంగానే ఉంది. అందువల్ల, L1 పొరపై దృష్టి సారించి, GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క అధిక-రిజల్యూషన్ పరిమాణాత్మక పటాలను లెక్కించడానికి మేము qmRGA-వ్యక్తీకరించే మొక్కలు మరియు pCLV3::mCherry-NLS స్టెమ్ సెల్ రిపోర్టర్35ని ఉపయోగించాము (బాహ్యచర్మం; Fig. 4a, b, పద్ధతులు మరియు అనుబంధ పద్ధతులను చూడండి), ఎందుకంటే L1 SAM వృద్ధిని నియంత్రించడంలో కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది36. ఇక్కడ, pCLV3::mCherry-NLS వ్యక్తీకరణ GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క స్పాటియోటెంపోరల్ పంపిణీని విశ్లేషించడానికి స్థిర రేఖాగణిత సూచన బిందువును అందించింది37. పార్శ్వ అవయవ అభివృద్ధికి GA అవసరమని పరిగణించినప్పటికీ4, P3 దశ (Fig. 4a, b) నుండి ప్రారంభమయ్యే పూల ప్రిమోర్డియం (P)లో GA సిగ్నల్‌లు తక్కువగా ఉన్నాయని మేము గమనించాము, అయితే యువ P1 మరియు P2 ప్రిమోర్డియంలు మధ్య ప్రాంతంలో (Fig. 4a, b) మాదిరిగానే మితమైన కార్యాచరణను కలిగి ఉన్నాయని మేము గమనించాము. ఆర్గాన్ ప్రిమోర్డియం సరిహద్దుల వద్ద అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాలు కనుగొనబడ్డాయి, P1/P2 (సరిహద్దు వైపులా) నుండి ప్రారంభమై P4 వద్ద గరిష్ట స్థాయికి చేరుకున్నాయి, అలాగే ప్రిమోర్డియా మధ్య ఉన్న పరిధీయ ప్రాంతంలోని అన్ని కణాలలో (Fig. 4a, b మరియు అనుబంధ Fig. 8a, b). ఈ అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాలు బాహ్యచర్మంలో మాత్రమే కాకుండా L2 మరియు ఎగువ L3 పొరలలో కూడా గమనించబడ్డాయి (అనుబంధ Fig. 8b). qmRGA ఉపయోగించి SAMలో కనుగొనబడిన GA సిగ్నల్‌ల నమూనా కూడా కాలక్రమేణా మారలేదు (అనుబంధ Fig. 8c–f, k). మేము వివరంగా వర్గీకరించిన ఐదు స్వతంత్ర రేఖల నుండి T3 మొక్కల SAMలో qd17mRGA నిర్మాణం క్రమపద్ధతిలో తగ్గించబడినప్పటికీ, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP నిర్మాణంతో పొందిన ఫ్లోరోసెన్స్ నమూనాలను మేము విశ్లేషించగలిగాము (అనుబంధ Fig. 8g–j, l). ఈ నియంత్రణ రేఖలో, SAM లో ఫ్లోరోసెన్స్ నిష్పత్తిలో స్వల్ప మార్పులు మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి, కానీ SAM కేంద్రంలో TagBFP తో అనుబంధించబడిన VENUS లో స్పష్టమైన మరియు ఊహించని తగ్గుదలని మేము గమనించాము. qmRGA గమనించిన సిగ్నలింగ్ నమూనా mRGA-VENUS యొక్క GA-ఆధారిత క్షీణతను ప్రతిబింబిస్తుందని ఇది నిర్ధారిస్తుంది, కానీ qmRGA మెరిస్టెమ్ కేంద్రంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాలను అతిగా అంచనా వేయవచ్చని కూడా నిరూపిస్తుంది. సారాంశంలో, మా ఫలితాలు ప్రధానంగా ప్రిమోర్డియా పంపిణీని ప్రతిబింబించే GA సిగ్నలింగ్ నమూనాను వెల్లడిస్తాయి. ఇంటర్-ప్రిమోర్డియల్ ప్రాంతం (IPR) యొక్క ఈ పంపిణీ అభివృద్ధి చెందుతున్న ప్రిమోర్డియం మరియు మధ్య ప్రాంతం మధ్య అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల క్రమంగా ఏర్పాటు కారణంగా ఉంది, అదే సమయంలో ప్రిమోర్డియంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ తగ్గుతుంది (Fig. 4c, d).
GID1b మరియు GID1c గ్రాహకాల పంపిణీ (పైన చూడండి) GA గ్రాహకాల యొక్క అవకలన వ్యక్తీకరణ SAMలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల నమూనాను రూపొందించడంలో సహాయపడుతుందని సూచిస్తుంది. GA యొక్క అవకలన సంచితం ఇందులో ఉందా అని మేము ఆలోచించాము. ఈ అవకాశాన్ని పరిశోధించడానికి, మేము nlsGPS1 GA FRET సెన్సార్21ని ఉపయోగించాము. 100 నిమిషాల పాటు 10 μM GA4+7తో చికిత్స చేయబడిన nlsGPS1 యొక్క SAMలో పెరిగిన యాక్టివేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ కనుగొనబడింది (అనుబంధ చిత్రం 9a–e), ఇది nlsGPS1 SAMలో GA సాంద్రతలో మార్పులకు ప్రతిస్పందిస్తుందని సూచిస్తుంది, ఇది రూట్స్21లో చేసినట్లుగానే. nlsGPS1 యాక్టివేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ యొక్క ప్రాదేశిక పంపిణీ SAM యొక్క బయటి పొరలలో సాపేక్షంగా తక్కువ GA స్థాయిలను వెల్లడించింది, కానీ అవి SAM మధ్యలో మరియు సరిహద్దుల వద్ద పెరిగినట్లు చూపించింది (చిత్రం 4e మరియు అనుబంధ చిత్రం 9a,c). qmRGA ద్వారా వెల్లడి చేయబడిన దానితో పోల్చదగిన ప్రాదేశిక నమూనాతో SAMలో GA కూడా పంపిణీ చేయబడిందని ఇది సూచిస్తుంది. పరిపూరక విధానంగా, మేము SAMని ఫ్లోరోసెంట్ GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) లేదా Flతో మాత్రమే ప్రతికూల నియంత్రణగా పరిగణించాము. Fl సిగ్నల్ సెంట్రల్ ప్రాంతం మరియు ప్రిమోర్డియంతో సహా SAM అంతటా పంపిణీ చేయబడింది, అయితే తక్కువ తీవ్రతతో (Fig. 4j మరియు అనుబంధ Fig. 10d). దీనికి విరుద్ధంగా, మూడు GA-Fl ప్రత్యేకంగా ప్రిమోర్డియం సరిహద్దులలో మరియు మిగిలిన IPRలో వివిధ స్థాయిలలో పేరుకుపోయింది, GA7-Fl IPRలో అతిపెద్ద డొమైన్‌లో పేరుకుపోయింది (Fig. 4k మరియు అనుబంధ Fig. 10a,b). ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత యొక్క పరిమాణీకరణ Fl-చికిత్స చేయబడిన SAMతో పోలిస్తే GA-Fl-చికిత్స చేయబడిన SAMలో IPR నుండి నాన్-IPR తీవ్రత నిష్పత్తి ఎక్కువగా ఉందని వెల్లడించింది (Fig. 4l మరియు అనుబంధ Fig. 10c). మొత్తంగా, ఈ ఫలితాలు అవయవ సరిహద్దుకు దగ్గరగా ఉన్న IPR కణాలలో GA అధిక సాంద్రతలలో ఉందని సూచిస్తున్నాయి. ఇది SAM GA సిగ్నలింగ్ కార్యకలాపాల నమూనా అవయవ సరిహద్దుల దగ్గర ఉన్న IPR కణాలలో GA గ్రాహకాల యొక్క అవకలన వ్యక్తీకరణ మరియు GA యొక్క అవకలన సంచితం రెండింటి నుండి సంభవిస్తుందని సూచిస్తుంది. అందువల్ల, మా విశ్లేషణ GA సిగ్నలింగ్ యొక్క ఊహించని స్పాటియోటెంపోరల్ నమూనాను వెల్లడించింది, SAM మధ్యలో మరియు ప్రిమోర్డియంలో తక్కువ కార్యాచరణ మరియు పరిధీయ ప్రాంతంలో IPRలో అధిక కార్యాచరణ.
SAM లో అవకలన GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ పాత్రను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS యొక్క రియల్-టైమ్ టైమ్-లాప్స్ ఇమేజింగ్ ఉపయోగించి GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ, కణ విస్తరణ మరియు కణ విభజన మధ్య సహసంబంధాన్ని విశ్లేషించాము. వృద్ధి నియంత్రణలో GA పాత్రను దృష్టిలో ఉంచుకుని, కణ విస్తరణ పారామితులతో సానుకూల సహసంబంధం ఆశించబడింది. అందువల్ల, మేము మొదట GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ మ్యాప్‌లను సెల్ ఉపరితల వృద్ధి రేటు యొక్క మ్యాప్‌లతో (ఇచ్చిన కణానికి మరియు విభజనలో కుమార్తె కణాలకు కణ విస్తరణ బలానికి ప్రాక్సీగా) మరియు కణ విస్తరణ దిశాత్మకతను కొలిచే వృద్ధి అనిసోట్రోపి యొక్క మ్యాప్‌లతో పోల్చాము (ఇచ్చిన కణానికి మరియు విభజనలో కుమార్తె కణాలకు కూడా ఇక్కడ ఉపయోగించబడుతుంది; Fig. 5a,b, పద్ధతులు మరియు అనుబంధ పద్ధతులను చూడండి). SAM సెల్ ఉపరితల వృద్ధి రేటు యొక్క మా మ్యాప్‌లు మునుపటి పరిశీలనలకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి 38,39, సరిహద్దు వద్ద కనిష్ట వృద్ధి రేట్లు మరియు అభివృద్ధి చెందుతున్న పువ్వులలో గరిష్ట వృద్ధి రేట్లు (Fig. 5a). ప్రధాన భాగం విశ్లేషణ (PCA) GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ కణ ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రతతో ప్రతికూలంగా సంబంధం కలిగి ఉందని చూపించింది (Figure 5c). GA సిగ్నలింగ్ ఇన్‌పుట్ మరియు పెరుగుదల తీవ్రతతో సహా వైవిధ్యం యొక్క ప్రధాన అక్షాలు అధిక CLV3 వ్యక్తీకరణ ద్వారా నిర్ణయించబడిన దిశకు లంబకోణీయంగా ఉన్నాయని కూడా మేము చూపించాము, ఇది మిగిలిన విశ్లేషణలలో SAM కేంద్రం నుండి కణాల మినహాయింపును నిర్ధారిస్తుంది. స్పియర్‌మ్యాన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ PCA ఫలితాలను నిర్ధారించింది (మూర్తి 5d), IPRలో అధిక GA సంకేతాలు అధిక కణ విస్తరణకు దారితీయలేదని సూచిస్తుంది. అయితే, సహసంబంధ విశ్లేషణ GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపి (మూర్తి 5c, d) మధ్య స్వల్ప సానుకూల సహసంబంధాన్ని వెల్లడించింది, ఇది IPRలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కణ పెరుగుదల దిశను మరియు బహుశా కణ విభజన విమానం యొక్క స్థానాన్ని ప్రభావితం చేస్తుందని సూచిస్తుంది.
a, b SAM లో సగటు ఉపరితల పెరుగుదల (a) మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపి (b) యొక్క ఉష్ణ పటాలు సగటున ఏడు స్వతంత్ర మొక్కలపై (వరుసగా కణ విస్తరణ బలం మరియు దిశకు ప్రాక్సీలుగా ఉపయోగించబడతాయి) ఉన్నాయి. c PCA విశ్లేషణలో ఈ క్రింది వేరియబుల్స్ ఉన్నాయి: GA సిగ్నల్, ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రత, ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపి మరియు CLV3 వ్యక్తీకరణ. PCA భాగం 1 ప్రధానంగా ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రతతో ప్రతికూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉంది మరియు GA సిగ్నల్‌తో సానుకూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉంది. PCA భాగం 2 ప్రధానంగా ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపితో సానుకూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉంది మరియు CLV3 వ్యక్తీకరణతో ప్రతికూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉంది. శాతాలు ప్రతి భాగం ద్వారా వివరించబడిన వైవిధ్యాన్ని సూచిస్తాయి. d CZ మినహా కణజాల స్కేల్ వద్ద GA సిగ్నల్, ఉపరితల పెరుగుదల తీవ్రత మరియు ఉపరితల పెరుగుదల అనిసోట్రోపి మధ్య స్పియర్‌మ్యాన్ సహసంబంధ విశ్లేషణ. కుడి వైపున ఉన్న సంఖ్య రెండు వేరియబుల్స్ మధ్య స్పియర్‌మ్యాన్ రో విలువ. సహసంబంధం/ప్రతికూల సహసంబంధం చాలా ముఖ్యమైన సందర్భాలను ఆస్టరిస్క్‌లు సూచిస్తాయి. e కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా Col-0 SAM L1 కణాల 3D విజువలైజేషన్. 10 h వద్ద SAMలో ఏర్పడిన కొత్త సెల్ గోడలు (కానీ ప్రిమోర్డియం కాదు) వాటి కోణ విలువల ప్రకారం రంగు వేయబడతాయి. రంగు పట్టీ దిగువ కుడి మూలలో చూపబడింది. ఇన్సెట్ 0 h వద్ద సంబంధిత 3D చిత్రాన్ని చూపుతుంది. ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది మరియు ఇలాంటి ఫలితాలు వచ్చాయి. f బాక్స్ ప్లాట్లు IPR మరియు నాన్-IPR Col-0 SAM (n = 10 స్వతంత్ర మొక్కలు)లో సెల్ విభజన రేట్లను ప్రదర్శిస్తాయి. మధ్య రేఖ మధ్యస్థాన్ని చూపుతుంది మరియు బాక్స్ సరిహద్దులు 25వ మరియు 75వ శాతాలను సూచిస్తాయి. మీసాలు R సాఫ్ట్‌వేర్‌తో నిర్ణయించబడిన కనిష్ట మరియు గరిష్ట విలువలను సూచిస్తాయి. P విలువలు వెల్చ్ యొక్క రెండు-తోక t-పరీక్షతో పొందబడ్డాయి. g, h SAM (తెల్ల చుక్కల రేఖ) నుండి రేడియల్ దిశకు సంబంధించి కొత్త సెల్ గోడ (మెజెంటా) కోణాన్ని ఎలా కొలవాలో (g) చూపించే స్కీమాటిక్ రేఖాచిత్రం (అక్యూట్ యాంగిల్ విలువలు, అంటే, 0–90°, మాత్రమే పరిగణించబడతాయి), మరియు (h) మెరిస్టెమ్‌లోని చుట్టుకొలత/పార్శ్వ మరియు రేడియల్ దిశలు. i వరుసగా SAM (ముదురు నీలం), IPR (మధ్యస్థ నీలం) మరియు నాన్-IPR (లేత నీలం) అంతటా కణ విభజన ప్లేన్ ఓరియంటేషన్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ హిస్టోగ్రామ్‌లు. P విలువలు రెండు-తోక గల కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్ష ద్వారా పొందబడ్డాయి. ఈ ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది మరియు ఇలాంటి ఫలితాలు వచ్చాయి. j వరుసగా P3 (లేత ఆకుపచ్చ), P4 (మధ్యస్థ ఆకుపచ్చ) మరియు P5 (ముదురు ఆకుపచ్చ) చుట్టూ ఉన్న IPR యొక్క కణ విభజన ప్లేన్ ఓరియంటేషన్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ హిస్టోగ్రామ్‌లు. P విలువలు రెండు-తోక గల కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్ష ద్వారా పొందబడ్డాయి. ఈ ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది మరియు ఇలాంటి ఫలితాలు వచ్చాయి.
అందువల్ల, మేము తదుపరి పరీక్ష సమయంలో కొత్తగా ఏర్పడిన సెల్ గోడలను గుర్తించడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ మరియు సెల్ డివిజన్ కార్యకలాపాల మధ్య సహసంబంధాన్ని పరిశోధించాము (Fig. 5e). ఈ విధానం కణ విభజన యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ మరియు దిశను కొలవడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. ఆశ్చర్యకరంగా, IPR మరియు మిగిలిన SAM (నాన్-IPR, Fig. 5f)లో కణ విభజనల ఫ్రీక్వెన్సీ ఒకేలా ఉందని మేము కనుగొన్నాము, ఇది IPR మరియు నాన్-IPR కణాల మధ్య GA సిగ్నలింగ్‌లో తేడాలు కణ విభజనను గణనీయంగా ప్రభావితం చేయవని సూచిస్తుంది. ఇది మరియు GA సిగ్నలింగ్ మరియు గ్రోత్ అనిసోట్రోపి మధ్య సానుకూల సహసంబంధం, GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ కణ విభజన విమానం యొక్క విన్యాసాన్ని ప్రభావితం చేయగలదా అని పరిగణించమని మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది. కొత్త కణ గోడ యొక్క విన్యాసాన్ని మేము మెరిస్టెమ్ సెంటర్ మరియు కొత్త కణ గోడ మధ్యభాగాన్ని కలిపే రేడియల్ అక్షానికి సంబంధించి తీవ్రమైన కోణంగా కొలిచాము (Fig. 5e-i) మరియు రేడియల్ అక్షానికి సంబంధించి 90°కి దగ్గరగా ఉన్న కోణాలలో కణాలు విభజించబడే స్పష్టమైన ధోరణిని గమనించాము, అత్యధిక పౌనఃపున్యాలు 70–80° (23.28%) మరియు 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i) వద్ద గమనించబడ్డాయి, ఇవి చుట్టుకొలత/విలోమ దిశలో కణ విభజనలకు అనుగుణంగా ఉంటాయి (Fig. 5h). ఈ కణ విభజన ప్రవర్తనకు GA సిగ్నలింగ్ యొక్క సహకారాన్ని పరిశీలించడానికి, మేము IPR మరియు నాన్-IPRలలో కణ విభజన పారామితులను విడిగా విశ్లేషించాము (Fig. 5i). IPR కణాలలో విభజన కోణ పంపిణీ IPR కాని కణాలలో లేదా మొత్తం SAM లోని కణాలలో భిన్నంగా ఉందని మేము గమనించాము, IPR కణాలు పార్శ్వ/వృత్తాకార కణ విభజనల యొక్క అధిక నిష్పత్తిని ప్రదర్శిస్తాయి, అంటే, 70–80° మరియు 80–90° (వరుసగా 33.86% మరియు 30.71%) (33.86% మరియు 30.71%) (చిత్రం 5i). అందువల్ల, మా పరిశీలనలు అధిక GA సిగ్నలింగ్ మరియు చుట్టుకొలత దిశకు దగ్గరగా ఉన్న కణ విభజన విమానం ధోరణి మధ్య అనుబంధాన్ని వెల్లడించాయి, ఇది GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ మరియు పెరుగుదల అనిసోట్రోపి మధ్య సహసంబంధాన్ని పోలి ఉంటుంది (చిత్రం 5c, d). ఈ అనుబంధం యొక్క ప్రాదేశిక పరిరక్షణను మరింత స్థాపించడానికి, P3 నుండి ప్రారంభమయ్యే ప్రిమోర్డియం చుట్టూ ఉన్న IPR కణాలలో విభజన విమానం ధోరణిని మేము కొలిచాము, ఎందుకంటే P4 నుండి ప్రారంభమయ్యే ఈ ప్రాంతంలో అత్యధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ కనుగొనబడింది (చిత్రం 4). P3 మరియు P4 చుట్టూ ఉన్న IPR యొక్క విభజన కోణాలు గణాంకపరంగా ముఖ్యమైన తేడాలను చూపించలేదు, అయినప్పటికీ P4 చుట్టూ ఉన్న IPRలో పార్శ్వ కణ విభజనల యొక్క పెరిగిన ఫ్రీక్వెన్సీ గమనించబడింది (చిత్రం 5j). అయితే, P5 చుట్టూ ఉన్న IPR కణాలలో, కణ విభజన విమానం యొక్క ధోరణిలో వ్యత్యాసం గణాంకపరంగా ముఖ్యమైనదిగా మారింది, విలోమ కణ విభజనల ఫ్రీక్వెన్సీలో పదునైన పెరుగుదలతో (Fig. 5j). మొత్తంగా, ఈ ఫలితాలు GA సిగ్నలింగ్ SAMలో కణ విభజనల ధోరణిని నియంత్రించగలదని సూచిస్తున్నాయి, ఇది మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉంది40,41 అధిక GA సిగ్నలింగ్ IPRలో కణ విభజనల పార్శ్వ ధోరణిని ప్రేరేపిస్తుంది.
IPR లోని కణాలు ప్రిమోర్డియాలో కాకుండా ఇంటర్నోడ్‌లలోకి చేర్చబడతాయని అంచనా వేయబడింది2,42,43. IPR లోని కణ విభజనల విలోమ ధోరణి ఇంటర్నోడ్‌లలో ఎపిడెర్మల్ కణాల సమాంతర రేఖాంశ వరుసల సాధారణ సంస్థకు దారితీయవచ్చు. పైన వివరించిన మా పరిశీలనలు కణ విభజన దిశను నియంత్రించడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్ ఈ ప్రక్రియలో పాత్ర పోషిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
అనేక DELLA జన్యువుల పనితీరు కోల్పోవడం వలన ఒక నిర్మాణాత్మక GA ప్రతిస్పందన ఏర్పడుతుంది మరియు ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి డెల్లా మ్యూటెంట్‌లను ఉపయోగించవచ్చు44. మేము మొదట SAMలోని ఐదు DELLA జన్యువుల వ్యక్తీకరణ నమూనాలను విశ్లేషించాము. GUS లైన్ యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ ఫ్యూజన్45 GAI, RGA, RGL1, మరియు RGL2 (చాలా తక్కువ స్థాయిలో) SAMలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయని వెల్లడించింది (అనుబంధ చిత్రం 11a–d). ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ GAI mRNA ప్రత్యేకంగా ప్రిమోర్డియా మరియు అభివృద్ధి చెందుతున్న పువ్వులలో పేరుకుపోతుందని మరింత నిరూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 11e). RGL1 మరియు RGL3 mRNA SAM కానోపీ అంతటా మరియు పాత పువ్వులలో కనుగొనబడ్డాయి, అయితే RGL2 mRNA సరిహద్దు ప్రాంతంలో ఎక్కువగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM యొక్క కాన్ఫోకల్ ఇమేజింగ్ ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ ద్వారా గమనించిన వ్యక్తీకరణను నిర్ధారించింది మరియు SAM యొక్క మధ్య భాగంలో RGL3 ప్రోటీన్ పేరుకుపోతుందని చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 11i). pRGA::GFP-RGA లైన్ ఉపయోగించి, SAM లో RGA ప్రోటీన్ పేరుకుపోతుందని కూడా మేము కనుగొన్నాము, కానీ P4 నుండి ప్రారంభమయ్యే సరిహద్దు వద్ద దాని సమృద్ధి తగ్గుతుంది (అనుబంధ చిత్రం 11j). ముఖ్యంగా, RGL3 మరియు RGA యొక్క వ్యక్తీకరణ నమూనాలు qmRGA ద్వారా కనుగొనబడినట్లుగా IPR లో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణకు అనుగుణంగా ఉంటాయి (చిత్రం 4). అంతేకాకుండా, ఈ డేటా అన్ని DELLAలు SAM లో వ్యక్తీకరించబడిందని మరియు వాటి వ్యక్తీకరణ సమిష్టిగా మొత్తం SAM ని విస్తరించిందని సూచిస్తుంది.
తరువాత మేము వైల్డ్-టైప్ SAM (Ler, కంట్రోల్) మరియు gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 డెల్లా క్వింటపుల్ (గ్లోబల్) మ్యూటెంట్లలో సెల్ డివిజన్ పారామితులను విశ్లేషించాము (Fig. 6a, b). ఆసక్తికరంగా, వైల్డ్ రకం (Fig. 6c) తో పోలిస్తే డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్ SAM లో సెల్ డివిజన్ యాంగిల్ ఫ్రీక్వెన్సీల పంపిణీలో గణాంకపరంగా గణనీయమైన మార్పును మేము గమనించాము. డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్‌లో ఈ మార్పు 80–90° కోణాల (34.71% vs. 24.55%) ఫ్రీక్వెన్సీ పెరుగుదల మరియు కొంతవరకు 70–80° కోణాల (23.78% vs. 20.18%) కారణంగా జరిగింది, అంటే, విలోమ కణ విభజనలకు అనుగుణంగా (Fig. 6c). విలోమ కాని విభాగాల (0–60°) ఫ్రీక్వెన్సీ కూడా డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్‌లో తక్కువగా ఉంది (Fig. 6c). డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటాంట్ యొక్క SAM లో విలోమ కణ విభజనల ఫ్రీక్వెన్సీ గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 6b). వైల్డ్ రకంతో పోలిస్తే డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటాంట్‌లో IPR లో విలోమ కణ విభజనల ఫ్రీక్వెన్సీ కూడా ఎక్కువగా ఉంది (Fig. 6d). IPR ప్రాంతం వెలుపల, వైల్డ్ రకం కణ విభజన కోణాల యొక్క మరింత ఏకరీతి పంపిణీని కలిగి ఉంది, అయితే డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటాంట్ IPR (Fig. 6e) వంటి టాంజెన్షియల్ విభజనలను ఇష్టపడింది. GA పేరుకుపోయే GA-నిష్క్రియాత్మక ఉత్పరివర్తన నేపథ్యం అయిన ga2 ఆక్సిడేస్ (ga2ox) క్వింటపుల్ మ్యూటాంట్‌ల (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, మరియు ga2ox6-2) యొక్క SAM లో కణ విభజనల విన్యాసాన్ని కూడా మేము లెక్కించాము. GA స్థాయిల పెరుగుదలకు అనుగుణంగా, క్వింటపుల్ ga2ox ఉత్పరివర్తన పుష్పగుచ్ఛం యొక్క SAM Col-0 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 12a, b) కంటే పెద్దదిగా ఉంది మరియు Col-0 తో పోలిస్తే, క్వింటపుల్ ga2ox SAM కణ విభజన కోణాల యొక్క విభిన్నమైన పంపిణీని చూపించింది, కోణ ఫ్రీక్వెన్సీ 50° నుండి 90°కి పెరిగింది, అంటే మళ్ళీ టాంజెన్షియల్ విభజనలకు అనుకూలంగా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 12a–c). అందువల్ల, GA సిగ్నలింగ్ మరియు GA చేరడం యొక్క నిర్మాణాత్మక క్రియాశీలత IPR మరియు మిగిలిన SAMలో పార్శ్వ కణ విభజనలను ప్రేరేపిస్తుందని మేము చూపిస్తాము.
a, b కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి PI-స్టెయిన్డ్ Ler (a) మరియు గ్లోబల్ డెల్లా మ్యూటాంట్ (b) SAM యొక్క L1 పొర యొక్క 3D విజువలైజేషన్. 10-h వ్యవధిలో SAM (కానీ ప్రిమోర్డియం కాదు) లో ఏర్పడిన కొత్త సెల్ గోడలు చూపించబడ్డాయి మరియు వాటి కోణ విలువల ప్రకారం రంగులు వేయబడ్డాయి. ఇన్సెట్ 0 h వద్ద SAMని చూపిస్తుంది. రంగు పట్టీ దిగువ కుడి మూలలో ప్రదర్శించబడుతుంది. (b) లోని బాణం గ్లోబల్ డెల్లా మ్యూటాంట్‌లో సమలేఖనం చేయబడిన సెల్ ఫైళ్ల ఉదాహరణను సూచిస్తుంది. ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది మరియు ఇలాంటి ఫలితాలతో. ce Ler మరియు గ్లోబల్ డెల్లా మధ్య మొత్తం SAM (d), IPR (e), మరియు నాన్-IPR (f)లో సెల్ డివిజన్ ప్లేన్ ఓరియంటేషన్ల ఫ్రీక్వెన్సీ పంపిణీ యొక్క పోలిక. రెండు-తోక గల కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్షను ఉపయోగించి P విలువలను పొందారు. f, g Col-0 (i) మరియు pCUC2::gai-1-VENUS (j) ట్రాన్స్‌జెనిక్ మొక్కల PI-స్టెయిన్డ్ SAM యొక్క కాన్ఫోకల్ చిత్రాల 3D విజువలైజేషన్. (a, b) ప్యానెల్‌లు 10 గంటల్లోపు SAMలో ఏర్పడిన కొత్త సెల్ గోడలను (కానీ ప్రిమోర్డియా కాదు) చూపుతాయి. ఈ ప్రయోగం రెండుసార్లు పునరావృతమైంది మరియు ఇలాంటి ఫలితాలు వచ్చాయి. h–j Col-0 మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కల మధ్య మొత్తం SAM (h), IPR (i) మరియు నాన్-IPR (j)లో ఉన్న సెల్ డివిజన్ ప్లేన్ ఓరియంటేషన్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీ పంపిణీ యొక్క పోలిక. రెండు తోకల కోల్మోగోరోవ్-స్మిర్నోవ్ పరీక్షను ఉపయోగించి P విలువలను పొందారు.
తరువాత మేము IPR లో ప్రత్యేకంగా GA సిగ్నలింగ్‌ను నిరోధించే ప్రభావాన్ని పరీక్షించాము. ఈ ప్రయోజనం కోసం, VENUS కు అనుసంధానించబడిన ఆధిపత్య ప్రతికూల gai-1 ప్రోటీన్ యొక్క వ్యక్తీకరణను నడపడానికి మేము కోటిలిడాన్ కప్ 2 (CUC2) ప్రమోటర్‌ను ఉపయోగించాము (pCUC2::gai-1-VENUS లైన్‌లో). వైల్డ్-టైప్ SAM లో, CUC2 ప్రమోటర్ P4 నుండి సరిహద్దు కణాలతో సహా SAM లోని చాలా IPR ల వ్యక్తీకరణను నడుపుతుంది మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కలలో ఇలాంటి నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ గమనించబడింది (క్రింద చూడండి). pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కల SAM లేదా IPR అంతటా కణ విభజన కోణాల పంపిణీ వైల్డ్ రకం నుండి గణనీయంగా భిన్నంగా లేదు, అయినప్పటికీ ఊహించని విధంగా ఈ మొక్కలలో IPR లేని కణాలు 80–90° అధిక పౌనఃపున్యంలో విభజించబడ్డాయని మేము కనుగొన్నాము (చిత్రం 6f–j).
కణ విభజన దిశ SAM యొక్క జ్యామితిపై ఆధారపడి ఉంటుందని సూచించబడింది, ముఖ్యంగా కణజాల వక్రత ద్వారా ఉత్పన్నమయ్యే తన్యత ఒత్తిడి46. అందువల్ల డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటాంట్ మరియు pCUC2::gai-1-VENUS మొక్కలలో SAM ఆకారం మార్చబడిందా అని మేము అడిగాము. గతంలో నివేదించినట్లుగా12, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటాంట్ SAM పరిమాణం వైల్డ్ రకం కంటే పెద్దది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13a, b, d). CLV3 మరియు STM RNA యొక్క ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ డెల్లా మ్యూటాంట్లలో మెరిస్టెమ్ విస్తరణను నిర్ధారించింది మరియు స్టెమ్ సెల్ సముచితం యొక్క పార్శ్వ విస్తరణను మరింత చూపించింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13e, f, h, i). అయితే, SAM వక్రత రెండు జన్యురూపాలలో సమానంగా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13k, m, n, p). వైల్డ్ రకంతో పోలిస్తే వక్రతలో మార్పు లేకుండా gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 డెల్లా క్వాడ్రపుల్ మ్యూటాంట్‌లో పరిమాణంలో ఇదే విధమైన పెరుగుదలను మేము గమనించాము (అనుబంధ చిత్రం 13c, d, g, j, l, o, p). డెల్లా క్వాడ్రపుల్ మ్యూటాంట్‌లో కూడా కణ విభజన ధోరణి యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ ప్రభావితమైంది, కానీ డెల్లా మోనోలిథిక్ మ్యూటాంట్ కంటే తక్కువ స్థాయిలో (అనుబంధ చిత్రం 12d–f). వక్రతపై ప్రభావం లేకపోవడంతో పాటు, ఈ మోతాదు ప్రభావం, డెల్లా క్వాడ్రపుల్ మ్యూటాంట్‌లోని అవశేష RGL3 కార్యాచరణ DELLA కార్యాచరణ కోల్పోవడం వల్ల కలిగే కణ విభజన ధోరణిలో మార్పులను పరిమితం చేస్తుందని మరియు SAM జ్యామితిలో మార్పులకు బదులుగా GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణలో మార్పులకు ప్రతిస్పందనగా పార్శ్వ కణ విభజనలలో మార్పులు సంభవిస్తాయని సూచిస్తుంది. పైన వివరించిన విధంగా, CUC2 ప్రమోటర్ P4 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 14a, b) నుండి SAMలో IPR వ్యక్తీకరణను డ్రైవ్ చేస్తుంది మరియు దీనికి విరుద్ధంగా, pCUC2::gai-1-VENUS SAM పరిమాణం తగ్గింది కానీ అధిక వక్రతను కలిగి ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM పదనిర్మాణంలో ఈ మార్పు వైల్డ్ రకంతో పోలిస్తే యాంత్రిక ఒత్తిళ్ల పంపిణీకి దారితీయవచ్చు, దీనిలో అధిక చుట్టుకొలత ఒత్తిళ్లు SAM కేంద్రం నుండి తక్కువ దూరంలో ప్రారంభమవుతాయి47. ప్రత్యామ్నాయంగా, pCUC2::gai-1-VENUS SAM పదనిర్మాణంలో మార్పులు ట్రాన్స్‌జీన్ వ్యక్తీకరణ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ప్రాంతీయ యాంత్రిక లక్షణాలలో మార్పుల ఫలితంగా ఉండవచ్చు48. రెండు సందర్భాల్లో, ఇది మా పరిశీలనలను వివరిస్తూ, చుట్టుకొలత/విలోమ ధోరణిలో కణాలు విభజించబడే సంభావ్యతను పెంచడం ద్వారా GA సిగ్నలింగ్‌లో మార్పుల ప్రభావాలను పాక్షికంగా భర్తీ చేయగలదు.
కలిసి చూస్తే, IPR లో కణ విభజన విమానం యొక్క పార్శ్వ ధోరణిలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ చురుకైన పాత్ర పోషిస్తుందని మా డేటా నిర్ధారిస్తుంది. మెరిస్టెమ్ వక్రత IPR లో కణ విభజన విమానం యొక్క ధోరణిని కూడా ప్రభావితం చేస్తుందని కూడా అవి చూపిస్తున్నాయి.
అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ కారణంగా IPRలో డివిజన్ ప్లేన్ యొక్క విలోమ విన్యాసం, తరువాత ఎపిడెర్మల్ ఇంటర్నోడ్‌లో కనుగొనబడే సెల్యులార్ ఆర్గనైజేషన్‌ను నిర్వచించడానికి SAMలోని ఎపిడెర్మిస్‌లో GA ఒక రేడియల్ సెల్ ఫైల్‌ను ముందస్తుగా నిర్వహిస్తుందని సూచిస్తుంది. నిజానికి, డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్స్ యొక్క SAM చిత్రాలలో ఇటువంటి సెల్ ఫైల్‌లు తరచుగా కనిపించాయి (Fig. 6b). అందువల్ల, SAMలో GA సిగ్నలింగ్ యొక్క ప్రాదేశిక నమూనా యొక్క అభివృద్ధి పనితీరును మరింత అన్వేషించడానికి, వైల్డ్-టైప్ (Ler మరియు Col-0), డెల్లా గ్లోబల్ మ్యూటెంట్స్ మరియు pCUC2::gai-1-VENUS ట్రాన్స్‌జెనిక్ ప్లాంట్లలో IPRలోని కణాల ప్రాదేశిక సంస్థను విశ్లేషించడానికి మేము టైమ్-లాప్స్ ఇమేజింగ్‌ను ఉపయోగించాము.
IPR లో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ P1/P2 నుండి పెరిగి P4 వద్ద గరిష్ట స్థాయికి చేరుకుందని qmRGA చూపించిందని మేము కనుగొన్నాము మరియు ఈ నమూనా కాలక్రమేణా స్థిరంగా ఉంది (Fig. 4a–f మరియు అనుబంధ Fig. 8c–f, k). పెరుగుతున్న GA సిగ్నల్‌తో IPR లోని కణాల ప్రాదేశిక సంస్థను విశ్లేషించడానికి, మొదటి పరిశీలన తర్వాత 34 గంటలు విశ్లేషించిన వాటి అభివృద్ధి విధి ప్రకారం మేము Ler IPR కణాలను P4 పైన మరియు వైపులా లేబుల్ చేసాము, అంటే, రెండు కంటే ఎక్కువ ప్లాస్టిడ్ సమయాలు, P1/P2 నుండి P4 వరకు ప్రిమోర్డియం అభివృద్ధి సమయంలో IPR కణాలను అనుసరించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. మేము మూడు వేర్వేరు రంగులను ఉపయోగించాము: P4 సమీపంలోని ప్రిమోర్డియంలో విలీనం చేయబడిన కణాలకు పసుపు, IPRలో ఉన్న వాటికి ఆకుపచ్చ మరియు రెండు ప్రక్రియలలో పాల్గొన్న వాటికి ఊదా (Fig. 7a–c). t0 (0 h) వద్ద, P4 ముందు 1-2 పొరల IPR కణాలు కనిపించాయి (Fig. 7a). ఊహించినట్లుగానే, ఈ కణాలు విభజించబడినప్పుడు, అవి ప్రధానంగా విలోమ విభజన విమానం ద్వారా అలా చేశాయి (Figs. 7a–c). Col-0 SAM (P3 పై దృష్టి సారించడం, దీని సరిహద్దు Ler లో P4 మాదిరిగానే ముడుచుకుంటుంది) ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి, అయితే ఈ జన్యురూపంలో పూల సరిహద్దు వద్ద ఏర్పడిన మడత IPR కణాలను మరింత త్వరగా దాచిపెట్టింది (Fig. 7g–i). అందువల్ల, IPR కణాల విభజన నమూనా కణాలను ఇంటర్నోడ్‌లలో వలె రేడియల్ వరుసలుగా ముందస్తుగా నిర్వహిస్తుంది. రేడియల్ వరుసల సంస్థ మరియు వరుస అవయవాల మధ్య IPR కణాల స్థానికీకరణ ఈ కణాలు ఇంటర్నోడల్ పూర్వీకులు అని సూచిస్తున్నాయి.
ఇక్కడ, మేము రేషియోమెట్రిక్ GA సిగ్నలింగ్ బయోసెన్సర్, qmRGA ను అభివృద్ధి చేసాము, ఇది మిశ్రమ GA మరియు GA గ్రాహక సాంద్రతల ఫలితంగా ఏర్పడే GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క పరిమాణాత్మక మ్యాపింగ్‌ను అనుమతిస్తుంది, అదే సమయంలో ఎండోజెనస్ సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో జోక్యాన్ని తగ్గిస్తుంది, తద్వారా సెల్యులార్ స్థాయిలో GA ఫంక్షన్‌పై సమాచారాన్ని అందిస్తుంది. ఈ ప్రయోజనం కోసం, మేము సవరించిన DELLA ప్రోటీన్, mRGA ను నిర్మించాము, ఇది DELLA ఇంటరాక్షన్ భాగస్వాములను బంధించే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోయింది కానీ GA-ప్రేరిత ప్రోటీయోలిసిస్‌కు సున్నితంగా ఉంటుంది. qmRGA GA స్థాయిలలో బాహ్య మరియు అంతర్జాత మార్పులకు ప్రతిస్పందిస్తుంది మరియు దాని డైనమిక్ సెన్సింగ్ లక్షణాలు అభివృద్ధి సమయంలో GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణలో స్పాటియోటెంపోరల్ మార్పులను అంచనా వేయడానికి వీలు కల్పిస్తాయి. qmRGA కూడా చాలా సరళమైన సాధనం, ఎందుకంటే దీనిని దాని వ్యక్తీకరణకు ఉపయోగించే ప్రమోటర్‌ను మార్చడం ద్వారా (అవసరమైతే) వివిధ కణజాలాలకు అనుగుణంగా మార్చవచ్చు మరియు GA సిగ్నలింగ్ మార్గం యొక్క సంరక్షించబడిన స్వభావం మరియు యాంజియోస్పెర్మ్‌లలో PFYRE మోటిఫ్‌ను ఇచ్చినట్లయితే, ఇది ఇతర జాతులకు బదిలీ చేయబడే అవకాశం ఉంది22. దీనికి అనుగుణంగా, బియ్యం SLR1 DELLA ప్రోటీన్ (HYY497AAA) లోని సమానమైన మ్యుటేషన్ కూడా SLR1 యొక్క పెరుగుదల అణచివేత చర్యను అణిచివేస్తుందని చూపబడింది, అదే సమయంలో mRGA23 మాదిరిగానే దాని GA-మధ్యవర్తిత్వ క్షీణతను కొద్దిగా తగ్గిస్తుంది. ముఖ్యంగా, అరబిడోప్సిస్‌లో ఇటీవలి అధ్యయనాలు PFYRE డొమైన్ (S474L) లోని ఒకే అమైనో ఆమ్ల మ్యుటేషన్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకం భాగస్వాములతో సంకర్షణ చెందే సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేయకుండా RGA యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ కార్యాచరణను మార్చిందని చూపించాయి. ఈ మ్యుటేషన్ mRGA లో ఉన్న 3 అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలకు చాలా దగ్గరగా ఉన్నప్పటికీ, ఈ రెండు ఉత్పరివర్తనలు DELLA యొక్క విభిన్న లక్షణాలను మారుస్తాయని మా అధ్యయనాలు చూపిస్తున్నాయి. చాలా ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకం భాగస్వాములు DELLA26,51 యొక్క LHR1 మరియు SAW డొమైన్‌లకు కట్టుబడి ఉన్నప్పటికీ, PFYRE డొమైన్‌లోని కొన్ని సంరక్షించబడిన అమైనో ఆమ్లాలు ఈ పరస్పర చర్యలను స్థిరీకరించడంలో సహాయపడతాయి.
మొక్కల నిర్మాణం మరియు దిగుబడి మెరుగుదలలో ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధి ఒక ముఖ్యమైన లక్షణం. qmRGA IPR ఇంటర్నోడ్ ప్రొజెనిటర్ కణాలలో అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణను వెల్లడించింది. పరిమాణాత్మక ఇమేజింగ్ మరియు జన్యుశాస్త్రాలను కలపడం ద్వారా, GA సిగ్నలింగ్ నమూనాలు SAM బాహ్యచర్మంలో వృత్తాకార/విలోమ కణ విభజన విమానాలను అతివ్యాప్తి చేస్తాయని, ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధికి అవసరమైన కణ విభజన సంస్థను రూపొందిస్తాయని మేము చూపించాము. అభివృద్ధి సమయంలో కణ విభజన ప్లేన్ ఓరియంటేషన్ యొక్క అనేక నియంత్రకాలు గుర్తించబడ్డాయి52,53. GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ ఈ సెల్యులార్ పరామితిని ఎలా నియంత్రిస్తుందో మా పని స్పష్టమైన ఉదాహరణను అందిస్తుంది. DELLA ప్రీఫోల్డింగ్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లతో సంకర్షణ చెందగలదు41, కాబట్టి GA సిగ్నలింగ్ కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఓరియంటేషన్‌ను నేరుగా ప్రభావితం చేయడం ద్వారా కణ విభజన ప్లేన్ ఓరియంటేషన్‌ను నియంత్రిస్తుంది40,41,54,55. SAMలో, అధిక GA సిగ్నలింగ్ కార్యాచరణ యొక్క సహసంబంధం సెల్ పొడుగు లేదా విభజన కాదని, పెరుగుదల అనిసోట్రోపి మాత్రమే అని మేము ఊహించని విధంగా చూపించాము, ఇది IPRలో కణ విభజన దిశపై GA యొక్క ప్రత్యక్ష ప్రభావానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది. అయితే, ఈ ప్రభావం పరోక్షంగా కూడా ఉండవచ్చని మేము మినహాయించలేము, ఉదాహరణకు GA-ప్రేరిత సెల్ గోడ మృదుత్వం ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించడం56. సెల్ గోడ లక్షణాలలో మార్పులు యాంత్రిక ఒత్తిడిని ప్రేరేపిస్తాయి57,58, ఇది కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క విన్యాసాన్ని ప్రభావితం చేయడం ద్వారా సెల్ విభజన విమానం యొక్క విన్యాసాన్ని కూడా ప్రభావితం చేస్తుంది39,46,59. GA-ప్రేరిత యాంత్రిక ఒత్తిడి మరియు GA ద్వారా మైక్రోట్యూబ్యూల్ విన్యాసాన్ని ప్రత్యక్షంగా నియంత్రించడం యొక్క మిశ్రమ ప్రభావాలు ఇంటర్నోడ్‌లను నిర్వచించడానికి IPRలో కణ విభజన విన్యాసం యొక్క నిర్దిష్ట నమూనాను రూపొందించడంలో పాల్గొనవచ్చు మరియు ఈ ఆలోచనను పరీక్షించడానికి మరిన్ని అధ్యయనాలు అవసరం. అదేవిధంగా, మునుపటి అధ్యయనాలు ఇంటర్నోడ్ నిర్మాణం నియంత్రణలో DELLA-ఇంటరాక్టింగ్ ప్రోటీన్లు TCP14 మరియు 15 యొక్క ప్రాముఖ్యతను హైలైట్ చేశాయి60,61 మరియు ఈ కారకాలు ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధిని నియంత్రించే BREVIPEDICELLUS (BP) మరియు PENNYWISE (PNY) లతో కలిసి GA చర్యను మధ్యవర్తిత్వం చేయవచ్చు2,62. డెల్లాలు బ్రాసినోస్టెరాయిడ్, ఇథిలీన్, జాస్మోనిక్ ఆమ్లం మరియు అబ్సిసిక్ ఆమ్లం (ABA) సిగ్నలింగ్ మార్గాలతో సంకర్షణ చెందుతాయి మరియు ఈ హార్మోన్లు మైక్రోట్యూబ్యూల్ ధోరణిని ప్రభావితం చేయగలవు కాబట్టి, కణ విభజన ధోరణిపై GA యొక్క ప్రభావాలు ఇతర హార్మోన్ల ద్వారా కూడా మధ్యవర్తిత్వం వహించబడవచ్చు.
అరబిడోప్సిస్ SAM యొక్క లోపలి మరియు బయటి ప్రాంతాలు రెండూ ఇంటర్నోడ్ అభివృద్ధికి అవసరమని ప్రారంభ సైటోలాజికల్ అధ్యయనాలు చూపించాయి2,42. GA అంతర్గత కణజాలాలలో కణ విభజనను చురుకుగా నియంత్రిస్తుందనే వాస్తవం12 SAMలో మెరిస్టెమ్ మరియు ఇంటర్నోడ్ పరిమాణాన్ని నియంత్రించడంలో GA యొక్క ద్వంద్వ పనితీరును సమర్థిస్తుంది. దిశాత్మక కణ విభజన యొక్క నమూనా లోపలి SAM కణజాలంలో కూడా కఠినంగా నియంత్రించబడుతుంది మరియు ఈ నియంత్రణ కాండం పెరుగుదలకు అవసరం52. అంతర్గత SAM సంస్థలో కణ విభజన విమానం దిశను నిర్దేశించడంలో GA కూడా పాత్ర పోషిస్తుందా, తద్వారా SAM లోపల ఇంటర్నోడ్‌ల స్పెసిఫికేషన్ మరియు అభివృద్ధిని సమకాలీకరిస్తుందా అని పరిశీలించడం ఆసక్తికరంగా ఉంటుంది.
మొక్కలను మట్టిలో విట్రోలో పెంచారు లేదా ప్రామాణిక పరిస్థితులలో (16 h కాంతి, 22 °C) 1% సుక్రోజ్ మరియు 1% అగర్ (సిగ్మా) తో అనుబంధంగా 1x మురాషిగే-స్కూగ్ (MS) మాధ్యమం (డుచెఫా) ను పెంచారు, హైపోకోటైల్ మరియు వేర్ల పెరుగుదల ప్రయోగాలు తప్ప, స్థిరమైన కాంతి మరియు 22 °C కింద నిలువు పలకలపై మొలకలను పెంచారు. నైట్రేట్ ప్రయోగాల కోసం, మొక్కలను సవరించిన MS మాధ్యమంలో (బయోవరల్డ్ ప్లాంట్ మాధ్యమం) తగినంత నైట్రేట్ (0 లేదా 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-సక్సినేట్, 1% సుక్రోజ్ మరియు 1% A-అగర్ (సిగ్మా) తో దీర్ఘ-రోజు పరిస్థితులలో పెంచారు.
pDONR221 లో చొప్పించిన GID1a cDNA ను pDONR P4-P1R-pUBQ10 తో మరియు pDONR P2R-P3-mCherry తో pB7m34GW తో కలిపి pUBQ10::GID1a-mCherry ను ఉత్పత్తి చేశారు. pDONR221 లో చొప్పించిన IDD2 DNA ను pB7RWG266 లోకి కలిపి p35S:IDD2-RFP ను ఉత్పత్తి చేశారు. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, GID1b కోడింగ్ ప్రాంతం యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్‌లో 3.9 kb ఫ్రాగ్మెంట్ మరియు GID1b cDNA (1.3 kb) మరియు టెర్మినేటర్ (3.4 kb) కలిగిన 4.7 kb ఫ్రాగ్మెంట్‌ను మొదట సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 3 లోని ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి యాంప్లిఫై చేసి, ఆపై వరుసగా pDONR P4-P1R (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) మరియు pDONR P2R-P3 (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) లలో చొప్పించి, చివరకు గేట్‌వే క్లోనింగ్ ఉపయోగించి pGreen 012567 టార్గెట్ వెక్టర్‌లో pDONR221 2xmTQ268 తో తిరిగి కలపబడ్డాయి. pCUC2::LSSmOrange ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, CUC2 ప్రమోటర్ సీక్వెన్స్ (ATG యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ 3229 bp) తరువాత N7 న్యూక్లియర్ లోకలైజేషన్ సిగ్నల్‌తో పెద్ద స్టోక్స్-షిఫ్ట్ చేయబడిన mOrange (LSSmOrange)69 యొక్క కోడింగ్ సీక్వెన్స్ మరియు NOS ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ టెర్మినేటర్‌ను గేట్‌వే 3-ఫ్రాగ్మెంట్ రీకాంబినేషన్ సిస్టమ్ (ఇన్విట్రోజెన్) ఉపయోగించి pGreen కనామైసిన్ టార్గెటింగ్ వెక్టర్‌లోకి అసెంబుల్ చేశారు. ప్లాంట్ బైనరీ వెక్టర్‌ను ఆగ్రోబాక్టీరియం ట్యూమెఫేసియన్స్ స్ట్రెయిన్ GV3101 లోకి ప్రవేశపెట్టారు మరియు ఆగ్రోబాక్టీరియం ఇన్‌ఫిల్ట్రేషన్ పద్ధతి ద్వారా నికోటియానా బెంథామియానా ఆకులలోకి మరియు ఫ్లోరల్ డిప్ పద్ధతి ద్వారా అరబిడోప్సిస్ థాలియానా కోల్-0 లోకి వరుసగా ప్రవేశపెట్టారు. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry మరియు pCLV3::mCherry-NLS qmRGA వరుసగా సంబంధిత శిలువల F3 మరియు F1 సంతానాల నుండి వేరుచేయబడ్డాయి.
సుమారు 1 సెం.మీ పొడవున్న షూట్ టిప్స్72 పై RNA ఇన్ సిటు హైబ్రిడైజేషన్ నిర్వహించబడింది, వీటిని సేకరించి వెంటనే FAA ద్రావణంలో (3.7% ఫార్మాల్డిహైడ్, 5% ఎసిటిక్ యాసిడ్, 50% ఇథనాల్) 4 °C కు ముందే చల్లబరిచారు. 2 × 15 నిమిషాల వాక్యూమ్ చికిత్సల తర్వాత, ఫిక్సేటివ్ మార్చబడింది మరియు నమూనాలను రాత్రిపూట పొదిగించారు. రోసియర్ మరియు ఇతరులు వివరించిన విధంగా అనుబంధ పట్టిక 3 లో చూపిన ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, మరియు RGL3 cDNA లు మరియు వాటి 3′-UTR లకు యాంటిసెన్స్ ప్రోబ్‌లను సంశ్లేషణ చేశారు. డిగోక్సిజెనిన్-లేబుల్ చేయబడిన ప్రోబ్‌లను డిగోక్సిజెనిన్ యాంటీబాడీస్ (3000-రెట్లు డైల్యూషన్; రోచె, కేటలాగ్ నంబర్: 11 093 274 910) ఉపయోగించి ఇమ్యునోడిటెక్ట్ చేశారు మరియు విభాగాలను 5-బ్రోమో-4-క్లోరో-3-ఇండోలైల్ ఫాస్ఫేట్ (BCIP, 250-రెట్లు డైల్యూషన్)/నైట్రోబ్లూ టెట్రాజోలియం (NBT, 200-రెట్లు డైల్యూషన్) ద్రావణంతో మరకలు చేశారు.