మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే నూతన మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాలుగా ఉర్సా మోనోఅమైడ్‌ల ఆవిష్కరణ, లక్షణ నిర్ధారణ మరియు క్రియాత్మక మెరుగుదల.

Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, మీరు మీ బ్రౌజర్ యొక్క కొత్త వెర్షన్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. ఈలోగా, నిరంతర మద్దతును అందించడానికి, మేము ఈ సైట్‌ను స్టైలింగ్ లేదా జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా చూపిస్తున్నాము.
సహజ ఉత్పత్తుల ఆవిష్కరణ మరియు ప్రయోజనకరమైన ఉపయోగం మానవ జీవితాన్ని మెరుగుపరచడంలో సహాయపడతాయి. మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధించే రసాయనాలను కలుపు మొక్కలను నియంత్రించడానికి కలుపు సంహారకాలుగా విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తారు. వివిధ రకాల కలుపు సంహారకాలను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం ఉన్నందున, కొత్త కార్యాచరణ విధానాలు కలిగిన సమ్మేళనాలను గుర్తించాల్సిన అవసరం ఉంది. ఈ అధ్యయనంలో, మేము స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రాన్సిస్ MK493-CF1 నుండి కౌమామోనామైడ్ అనే ఒక నూతన N-ఆల్కాక్సీపైరోల్ సమ్మేళనాన్ని కనుగొని, దాని పూర్తి సంశ్లేషణ ప్రక్రియను స్థాపించాము. జీవసంబంధ క్రియాశీలత పరీక్షల ద్వారా, ఉర్స్-మోనోఅమైడ్ యొక్క సంశ్లేషణ మధ్యంతరంగా ఉర్స్-మోనోఅమిక్ ఆమ్లం ఒక సంభావ్య సమ్మేళనం అని మేము కనుగొన్నాము.మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకందీనికి అదనంగా, మేము అర్బెనిలాక్సీ డెరివేటివ్ (UDA)తో సహా వివిధ అర్బెనోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను అభివృద్ధి చేశాము. ఇది HeLa కణాల పెరుగుదలను ప్రతికూలంగా ప్రభావితం చేయకుండా అధిక కలుపు సంహారక శక్తిని కలిగి ఉంటుంది. అర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను దెబ్బతీస్తాయని కూడా మేము కనుగొన్నాము; దీనికి అదనంగా, KAND యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను ప్రభావితం చేసి కణ మరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది; ఈ బహుముఖ ప్రభావాలు తెలిసిన మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాల ప్రభావాలకు భిన్నంగా ఉంటాయి మరియు అర్సోనిక్ ఆమ్లానికి ఒక కొత్త చర్యా విధానాన్ని సూచిస్తాయి, ఇది కొత్త కలుపు సంహారకాల అభివృద్ధిలో ఒక ముఖ్యమైన ప్రయోజనాన్ని సూచిస్తుంది.
ప్రయోజనకరమైన సహజ ఉత్పత్తులు మరియు వాటి ఉత్పన్నాలను కనుగొనడం, ఆచరణలో పెట్టడం అనేది మానవ జీవిత నాణ్యతను మెరుగుపరిచే ఒక మార్గం. సూక్ష్మజీవులు, మొక్కలు మరియు కీటకాల ద్వారా ఉత్పత్తి అయ్యే ద్వితీయ జీవక్రియ ఉత్పన్నాలు (సెకండరీ మెటబొలైట్స్) వైద్య, వ్యవసాయ రంగాలలో ప్రధాన పురోగతికి దారితీశాయి. అనేక యాంటీబయాటిక్స్ మరియు లుకేమియా నిరోధక మందులు సహజ ఉత్పత్తుల నుండి అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి. దీనికి అదనంగా, వివిధ రకాలపురుగుమందులువ్యవసాయంలో ఉపయోగించడం కోసం ఈ సహజ ఉత్పత్తుల నుండి శిలీంధ్రనాశకాలు మరియు కలుపునాశకాలను సంగ్రహిస్తారు. ముఖ్యంగా, ఆధునిక వ్యవసాయంలో పంట దిగుబడిని పెంచడానికి కలుపు నియంత్రణ కలుపునాశకాలు ముఖ్యమైన సాధనాలు, మరియు ఇప్పటికే వివిధ రకాల సమ్మేళనాలను వాణిజ్యపరంగా ఉపయోగిస్తున్నారు. మొక్కలలో కిరణజన్య సంయోగక్రియ, అమైనో ఆమ్ల జీవక్రియ, కణ గోడ సంశ్లేషణ, మైటోసిస్ నియంత్రణ, ఫైటోహార్మోన్ సిగ్నలింగ్ లేదా ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ వంటి అనేక కణ ప్రక్రియలు కలుపునాశకాల యొక్క సాధారణ లక్ష్యాలుగా పరిగణించబడతాయి. మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించే సమ్మేళనాలు ఒక సాధారణ రకమైన కలుపునాశకాలు, ఇవి మైటోటిక్ నియంత్రణను ప్రభావితం చేయడం ద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను ప్రభావితం చేస్తాయి2.
మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ సైటోస్కెలెటన్ యొక్క భాగాలు మరియు యూకారియోటిక్ కణాలలో విస్తృతంగా సంరక్షించబడతాయి. ట్యూబులిన్ హెటెరోడైమర్‌లో α-ట్యూబులిన్ మరియు β-ట్యూబులిన్ కలిసి సరళ మైక్రోట్యూబ్యూల్ ప్రోటోఫిలమెంట్లను ఏర్పరుస్తాయి, ఇందులో 13 ప్రోటోఫిలమెంట్లు స్థూపాకార నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తాయి. మొక్క కణాలలో మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ బహుళ పాత్రలను పోషిస్తాయి, వీటిలో కణ ఆకారాన్ని నిర్ణయించడం, కణ విభజన మరియు కణాంతర్గత రవాణా3,4 వంటివి ఉన్నాయి. మొక్క కణాలలో ఇంటర్‌ఫేస్ ప్లాస్మా పొర కింద మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ ఉంటాయి, మరియు ఈ కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ అని పిలవబడేవి సెల్యులోజ్ సింథేస్ కాంప్లెక్స్‌ల నియంత్రణ ద్వారా సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబ్రిల్స్ యొక్క వ్యవస్థీకరణను నియంత్రిస్తాయని భావిస్తున్నారు4,5. వేరు కొన యొక్క వేగవంతమైన పొడవు పెరుగుదల ప్రాంతంలో ఉండే వేరు బాహ్యచర్మ కణాల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ పార్శ్వంగా ఉంటాయి, మరియు సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబర్‌లు ఈ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను అనుసరించి కణ విస్తరణ దిశను పరిమితం చేస్తాయి, తద్వారా అసమదిశాత్మక కణ పొడవు పెరుగుదలను ప్రోత్సహిస్తాయి. అందువల్ల, మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరు మొక్క స్వరూపశాస్త్రంతో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. ట్యూబులిన్‌ను సంకేతపరిచే జన్యువులలోని అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలు అరాబిడోప్సిస్‌లో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ శ్రేణుల వక్రతకు మరియు ఎడమ లేదా కుడి వైపు పెరుగుదలకు కారణమవుతాయి 6,7. అదేవిధంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్ గతిశీలతను నియంత్రించే మైక్రోట్యూబ్యూల్-అనుబంధ ప్రోటీన్‌లలోని ఉత్పరివర్తనాలు కూడా వక్రీకరించిన వేరు పెరుగుదలకు దారితీయవచ్చు8,9,10,11,12,13. అదనంగా, ప్రిటిలాక్లోర్ అని కూడా పిలువబడే డైసోపైరమైడ్ వంటి మైక్రోట్యూబ్యూల్‌ను విచ్ఛిన్నం చేసే కలుపు సంహారకాలతో చికిత్స చేయడం కూడా ఎడమ వైపు ఏటవాలు వేరు పెరుగుదలకు కారణమవుతుంది14. ఈ డేటా, మొక్కల పెరుగుదల దిశను నిర్ధారించడానికి మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరు యొక్క కచ్చితమైన నియంత్రణ చాలా కీలకమని సూచిస్తుంది.
వివిధ రకాల మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాలు కనుగొనబడ్డాయి, మరియు ఈ మందులు సైటోస్కెలెటల్ పరిశోధనతో పాటు వ్యవసాయం మరియు వైద్య రంగాలకు కూడా గణనీయమైన తోడ్పాటును అందించాయి2. ముఖ్యంగా, ఒరైజాలిన్, డైనిట్రోఅనిలిన్ సమ్మేళనాలు, డైసోపైరమైడ్, బెంజమైడ్ సంబంధిత సమ్మేళనాలు మరియు వాటి అనలాగ్‌లు మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించి, తద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను అడ్డుకోగలవు. అందువల్ల, వీటిని కలుపు సంహారకాలుగా విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తున్నారు. అయితే, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మొక్క మరియు జంతు కణాలలో ఒక ముఖ్యమైన భాగం కాబట్టి, చాలా మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాలు ఈ రెండు రకాల కణాలకు విషపూరితమైనవి. అందువల్ల, కలుపు సంహారకాలుగా వాటి ఉపయోగం గుర్తించబడినప్పటికీ, ఆచరణాత్మక ప్రయోజనాల కోసం పరిమిత సంఖ్యలో యాంటీమైక్రోట్యూబ్యూల్ ఏజెంట్లను మాత్రమే ఉపయోగిస్తున్నారు.
స్ట్రెప్టోమైసెస్ అనేది స్ట్రెప్టోమైసెస్ కుటుంబానికి చెందిన ఒక ప్రజాతి. ఇందులో ఏరోబిక్, గ్రామ్-పాజిటివ్, తంతురూప బ్యాక్టీరియా ఉంటాయి మరియు ఇది విస్తృత శ్రేణి ద్వితీయ జీవక్రియా ఉత్పత్తులను ఉత్పత్తి చేసే సామర్థ్యానికి ప్రసిద్ధి చెందింది. అందువల్ల, ఇది కొత్త జీవక్రియాశీల సహజ ఉత్పత్తులకు అత్యంత ముఖ్యమైన వనరులలో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది. ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, మేము కౌమామోనామైడ్ అనే కొత్త సమ్మేళనాన్ని కనుగొన్నాము, దీనిని స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రాన్సిస్ MK493-CF1 మరియు S. వెర్రాన్సిస్ ISP 5486 నుండి వేరుచేయడం జరిగింది. స్పెక్ట్రల్ విశ్లేషణ మరియు పూర్తి స్పెక్ట్రల్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి, కౌమామోనామైడ్ యొక్క నిర్మాణాన్ని వర్గీకరించి, దాని ప్రత్యేకమైన N-ఆల్కాక్సీపైరోల్ అస్థిపంజరాన్ని నిర్ధారించడం జరిగింది. ఉర్స్మోనామైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క సంశ్లేషణ మధ్యంతరమైన ఉర్స్మోనిక్ ఆమ్లం, ప్రసిద్ధ నమూనా మొక్క అయిన అరాబిడోప్సిస్ థాలియానా యొక్క పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిని నిరోధిస్తుందని కనుగొనబడింది. నిర్మాణ-కార్యాచరణ సంబంధ అధ్యయనంలో, C9 ను ఉర్సోనిక్ ఆమ్లంగా మార్చిన ఒక సమ్మేళనం, అనగా ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క నోనిలాక్సీ ఉత్పన్నం (KAND), పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిపై నిరోధక ప్రభావాన్ని గణనీయంగా పెంచుతుందని మేము కనుగొన్నాము. ముఖ్యంగా, కొత్తగా కనుగొనబడిన ఈ మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్ పెరుగుదలను కూడా ప్రభావితం చేసింది మరియు బ్యాక్టీరియా లేదా హీలా కణాలకు విషపూరితం కాదు. అంతేకాకుండా, కొన్ని ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు వక్రీకరించిన వేరు ఫినోటైప్‌ను ప్రేరేపిస్తాయి, ఇది ఈ ఉత్పన్నాలు ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయని సూచిస్తుంది. ఈ ఆలోచనకు అనుగుణంగా, ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్‌గా లేదా ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌లతో లేబుల్ చేయబడిన మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై మా పరిశీలనలు, KAND చికిత్స మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను విచ్ఛిన్నం చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. అదనంగా, కుమామోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలతో చికిత్స యాక్టిన్ మైక్రోఫిలమెంట్లను దెబ్బతీసింది. ఈ విధంగా, సైటోస్కెలెటన్‌ను నాశనం చేసే ప్రత్యేకమైన కార్యాచరణ విధానం కలిగిన ఒక కొత్త మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాన్ని మేము కనుగొన్నాము.
టోక్యోలోని షినగావా-కులో ఉన్న మట్టి నుండి MK493-CF1 స్ట్రెయిన్‌ను వేరుచేయడం జరిగింది. MK493-CF1 స్ట్రెయిన్ బాగా శాఖలుగా విస్తరించిన స్ట్రోమల్ మైసీలియంను ఏర్పరిచింది. 16S రైబోసోమల్ RNA జన్యువు (1422 bp) యొక్క పాక్షిక క్రమాన్ని నిర్ధారించడం జరిగింది. ఈ స్ట్రెయిన్ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: విలక్షణమైన స్ట్రెయిన్, 99.93%)ను చాలా పోలి ఉంది. ఈ ఫలితం ఆధారంగా, ఈ స్ట్రెయిన్ S. werraensis యొక్క టైప్ స్ట్రెయిన్‌కు దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉందని నిర్ధారించబడింది. అందువల్ల, మేము ఈ స్ట్రెయిన్‌కు తాత్కాలికంగా S. werraensis MK493-CF1 అని నామకరణం చేశాము. S. werraensis ISP 5486T కూడా అవే జీవక్రియాశీల సమ్మేళనాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఈ సూక్ష్మజీవి నుండి సహజ ఉత్పత్తులను పొందడంపై ప్రారంభంలో తక్కువ పరిశోధన జరిగినందున, తదుపరి రసాయన పరిశోధన చేపట్టబడింది. 30°C వద్ద 14 రోజుల పాటు ఘనస్థితి కిణ్వ ప్రక్రియ ద్వారా బార్లీ మాధ్యమంలో S. werraensis MK493-CF1 ను సాగు చేసిన తర్వాత, ఆ మాధ్యమాన్ని 50% EtOH తో సంగ్రహించారు. 59.5 mg ముడి సారాన్ని పొందడానికి 60 ml నమూనాను ఎండబెట్టారు. ఆ ముడి సారాన్ని రివర్స్ ఫేజ్ HPLC కి గురిచేయగా N-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సమైడ్ (1, దీనికి కౌమామోనామైడ్ అని పేరు పెట్టారు, 36.0 mg) లభించింది. 1 యొక్క మొత్తం పరిమాణం ముడి సారంలో సుమారుగా 60% ఉంది. అందువల్ల, మేము కుమామోటోమైడ్ 1 యొక్క లక్షణాలను వివరంగా అధ్యయనం చేయాలని నిర్ణయించుకున్నాము.
కౌమామోనామైడ్ 1 ఒక తెల్లని నిరాకార పొడి మరియు అధిక రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (HRESIMS) C6H8N2O2 ను నిర్ధారిస్తుంది (పటం 1). ఈ సమ్మేళనం యొక్క C2-ప్రతిక్షేపిత పైరోల్ భాగం δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR స్పెక్ట్రంలో δH: 4.5 Hz, H-5) మరియు δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ల ద్వారా వర్గీకరించబడింది, మరియు 13C NMR స్పెక్ట్రం నాలుగు sp2 కార్బన్ పరమాణువుల ఉనికిని చూపిస్తుంది. C2 స్థానంలో ఒక అమైడ్ సమూహం యొక్క ఉనికిని C-3 ప్రోటాన్ నుండి δC 161.1 వద్ద ఉన్న అమైడ్ కార్బోనిల్ కార్బన్‌కు HMBC సహసంబంధం ద్వారా అంచనా వేయబడింది. అదనంగా, δH 4.10 (3H, S) మరియు δC 68.3 వద్ద ఉన్న 1H మరియు 13C NMR శిఖరాలు అణువులో N-మెథాక్సీ సమూహాల ఉనికిని సూచిస్తాయి. మెరుగైన వ్యత్యాస స్పెక్ట్రోస్కోపీ మరియు న్యూక్లియర్ ఓవర్‌హౌజర్ అబ్రివియేషన్ (NOEDF) వంటి స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి మెథాక్సీ సమూహం యొక్క సరైన స్థానం ఇంకా నిర్ధారించబడనప్పటికీ, N-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సమైడ్ మొదటి అభ్యర్థి సమ్మేళనంగా మారింది.
1 యొక్క సరైన నిర్మాణాన్ని నిర్ధారించడానికి, సంపూర్ణ సంశ్లేషణ నిర్వహించబడింది (పటం 2ఎ). వాణిజ్యపరంగా లభించే 2-అమినోపైరిడిన్ 2ను m-CPBAతో చర్య జరిపినప్పుడు, సంబంధిత N-ఆక్సైడ్ 3 పరిమాణాత్మక దిగుబడిలో లభించింది. 2 యొక్క 2-అమినోఅజైడేషన్ తర్వాత, అబ్రామోవిచ్ వివరించిన సైక్లోకండెన్సేషన్ చర్యను బెంజీన్‌లో 90°C వద్ద జరిపి, కావలసిన 1-హైడ్రాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బోనైట్రైల్ 5ను గ్రాములలో పొందారు. వేగం 60% (రెండు దశలు). 15,16. ఆ తర్వాత 4 యొక్క మిథైలేషన్ మరియు హైడ్రోలైసిస్ ద్వారా 1-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సిలిక్ ఆమ్లం ("కుమోటోనిక్ ఆమ్లం" అని పిలుస్తారు, 6) మంచి దిగుబడిలో (70%, రెండు దశలు) లభించింది. చివరగా, ఆమ్ల క్లోరైడ్ ఇంటర్మీడియట్ 6 ద్వారా జల అమ్మోనియాను ఉపయోగించి అమైడేషన్ జరిపినప్పుడు కుమామోటో అమైడ్ 1 98% దిగుబడిలో లభించింది. సంశ్లేషణ చేయబడిన 1 యొక్క అన్ని స్పెక్ట్రల్ డేటా వేరుచేయబడిన 1 మాదిరిగానే ఉన్నాయి, కాబట్టి 1 యొక్క నిర్మాణం నిర్ణయించబడింది;
అర్బెనమైడ్ మరియు అర్బెనిక్ ఆమ్లం యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాల సాధారణ సంశ్లేషణ మరియు విశ్లేషణ. (ఎ) కుమామోటో అమైడ్ యొక్క సంపూర్ణ సంశ్లేషణ. (బి) ఏడు రోజుల వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ అరాబిడోప్సిస్ కొలంబియా (Col) మొలకలను, సూచించిన గాఢతలలో కౌమామోనామైడ్ 6 లేదా కౌమామోనామైడ్ 1 కలిగిన మురాషిగే మరియు స్కూగ్ (MS) ప్లేట్లపై పెంచారు. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ.
మొదట, మొక్కల పెరుగుదలను నియంత్రించే సామర్థ్యం కోసం మేము అర్బెనమైడ్ మరియు దాని మధ్యంతరాల జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను అంచనా వేశాము. మేము MS అగర్ మాధ్యమంలో ఉర్స్మోనామైడ్ 1 లేదా ఉర్స్మోనిక్ ఆమ్లం 6 యొక్క వివిధ గాఢతలను జోడించి, ఈ మాధ్యమంలో అరాబిడోప్సిస్ థాలియానా మొలకలను పెంచాము. ఈ పరీక్షలు 6 యొక్క అధిక గాఢతలు (500 μM) వేరు పెరుగుదలను నిరోధించాయని చూపించాయి (పటం 2బి). తరువాత, మేము 6 యొక్క N1 స్థానాన్ని ప్రతిక్షేపించడం ద్వారా వివిధ ఉత్పన్నాలను ఉత్పత్తి చేసి, వాటిపై నిర్మాణం-కార్యాచరణ సంబంధ అధ్యయనాలను నిర్వహించాము (అనలాగ్ సంశ్లేషణ ప్రక్రియ సహాయక సమాచారంలో (SI) వివరించబడింది). 50 μM ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు కలిగిన మాధ్యమంలో అరాబిడోప్సిస్ మొలకలను పెంచి, వేరు పొడవును కొలిచాము, ఇది చిత్రంలో చూపబడింది. పటాలు 3a, b, మరియు S1 లలో చూపిన విధంగా, కౌమామో ఆమ్లాలు N1 స్థానంలో వివిధ పొడవుల సరళ ఆల్కాక్సీ గొలుసులను (9, 10, 11, 12, మరియు 13) లేదా పెద్ద ఆల్కాక్సీ గొలుసులను (15, 16, మరియు 17) కలిగి ఉంటాయి. ఈ ఉత్పన్నాలు వేరు పెరుగుదలను గణనీయంగా నిరోధించాయి. అదనంగా, 200 μM 10, 11, లేదా 17 ను ప్రయోగించడం మొలకెత్తడాన్ని నిరోధించిందని మేము కనుగొన్నాము (పటాలు 3c మరియు S2).
కుమామోటో అమైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాల నిర్మాణం-కార్యాచరణ సంబంధం యొక్క అధ్యయనం. (ఎ) అనలాగ్‌ల నిర్మాణం మరియు సంశ్లేషణ పథకం. (బి) 50 μM కౌమామోనామైడ్ ఉత్పన్నాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో పెరిగిన 7-రోజుల వయస్సు గల మొలకల వేరు పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ. నక్షత్ర గుర్తులు షామ్ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p).< 0.05). n>18. డేటా సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం (SD)గా చూపబడింది. nt అంటే "పరీక్షించబడలేదు" ఎందుకంటే 50% కంటే ఎక్కువ విత్తనాలు మొలకెత్తలేదు. (సి) 200 μM కౌమామోనామైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో 7 రోజులు పొదిగిన చికిత్స పొందిన విత్తనాల మొలకెత్తే రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ. నక్షత్ర గుర్తులు షామ్ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (చి-స్క్వేర్ పరీక్ష). n=96.
ఆసక్తికరంగా, C9 కంటే పొడవైన ఆల్కైల్ సైడ్ చైన్‌లను జోడించడం వలన నిరోధక చర్య తగ్గింది, ఇది కుమామోటోయిక్ ఆమ్ల సంబంధిత సమ్మేళనాలు వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రదర్శించడానికి ఒక నిర్దిష్ట పరిమాణంలో సైడ్ చైన్‌లు అవసరమని సూచిస్తుంది.
నిర్మాణ-కార్యాచరణ సంబంధ విశ్లేషణలో C9, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లంగా మార్పు చెందిందని మరియు ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క నోనిలాక్సీ ఉత్పన్నం (ఇకపై KAND 11గా పిలవబడుతుంది) అత్యంత ప్రభావవంతమైన మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం అని తేలినందున, మేము KAND 11 యొక్క మరింత వివరణాత్మక లక్షణీకరణను నిర్వహించాము. 50 μM KAND 11తో అరాబిడోప్సిస్‌కు చికిత్స చేయడం మొలకెత్తడాన్ని దాదాపు పూర్తిగా నిరోధించింది, అయితే KAND 11 యొక్క తక్కువ గాఢతలు (40, 30, 20, లేదా 10 μM) మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో వేరు పెరుగుదలను నిరోధించాయి (పటం 4a, b). KAND 11 వేరు మెరిస్టెమ్ జీవశక్తిని ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI)తో రంగు వేసిన వేరు మెరిస్టెమ్‌లను పరిశీలించి, మెరిస్టెమ్ వైశాల్య పరిమాణాన్ని కొలిచాము. 25 μM KAND-11 కలిగిన మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 151.1 ± 32.5 μm కాగా, DMSO కలిగిన నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 264.7 ± 30.8 μm (పటం 4c, d) గా ఉంది. ఇది KAND-11 కణ వ్యాప్తిని పునరుద్ధరిస్తుందని సూచిస్తుంది. వేరు మెరిస్టెమ్. దీనికి అనుగుణంగా, KAND 11 చికిత్స వేరు మెరిస్టెమ్‌లో కణ విభజన మార్కర్ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS సిగ్నల్ మొత్తాన్ని తగ్గించింది (పటం 4e) 17. ఈ ఫలితాలు KAND 11 కణ విస్తరణ కార్యకలాపాన్ని తగ్గించడం ద్వారా వేరు పెరుగుదలను నిరోధిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
పెరుగుదలపై అర్బెనోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాల (అర్బెనిలాక్సీ ఉత్పన్నాల) నిరోధక ప్రభావం యొక్క విశ్లేషణ. (ఎ) సూచించిన KAND 11 గాఢతలతో MS ప్లేట్లపై పెంచిన 7-రోజుల వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ Col మొలకలు. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ. (బి) వేరు పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టూకీ HSD పరీక్ష, p< 0.05). n>16. డేటా సగటు ± SD గా చూపబడింది. (సి) 25 μM KAND 11 తో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్లపై పెరిగిన ప్రోపిడియం అయోడైడ్-స్టెయిన్డ్ వైల్డ్-టైప్ Col వేర్ల కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ. తెల్లని బ్రాకెట్లు రూట్ మెరిస్టెమ్‌ను సూచిస్తాయి. స్కేల్ బార్ = 100 µm. (డి) రూట్ మెరిస్టెమ్ పరిమాణం యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 10 నుండి 11). t-టెస్ట్ (p < 0.05) ఉపయోగించి గణాంక వ్యత్యాసాలు నిర్ణయించబడ్డాయి.< 0.05). బార్‌లు సగటు మెరిస్టెమ్ పరిమాణాన్ని సూచిస్తాయి. (ఇ) CDKB2 కన్‌స్ట్రక్ట్‌ను కలిగి ఉన్న రూట్ మెరిస్టెమ్ యొక్క డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫెరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ (DIC) మైక్రోస్కోపీ; 1pro: CDKB2; 1-GUS స్టెయిన్ చేయబడింది మరియు 25 µM KAND అస్సేతో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్లపై పెరిగిన 5-రోజుల వయస్సు గల మొలకలపై స్టెయిన్ చేయబడింది.
KAND 11 యొక్క వృక్ష విషప్రభావాన్ని మరొక ద్విదళ మొక్క అయిన పొగాకు (నికోటియానా టాబాకమ్) మరియు ఒక ప్రధాన భూమిపై పెరిగే మొక్క నమూనా జీవి అయిన లివర్‌వోర్ట్ (మార్కాంటియా పాలిమోర్ఫా) ఉపయోగించి మరింతగా పరీక్షించారు. అరాబిడోప్సిస్ విషయంలో వలె, 25 μM KAND 11 కలిగిన మాధ్యమంలో పెరిగిన పొగాకు SR-1 మొలకలు పొట్టి వేర్లను ఉత్పత్తి చేశాయి (పటం 5a). అదనంగా, 200 μM KAND 11 కలిగిన ప్లేట్లపై 48 విత్తనాలలో 40 మొలకెత్తాయి, అయితే మాక్-ట్రీటెడ్ మాధ్యమాలపై 48 విత్తనాలన్నీ మొలకెత్తాయి, ఇది KAND యొక్క అధిక సాంద్రతలు గణనీయమైనవని సూచిస్తుంది (p< 0.05; చి టెస్ట్ -స్క్వేర్) పొగాకు మొలకెత్తడాన్ని నిరోధించింది. (పటం 5బి). అదనంగా, లివర్‌వోర్ట్‌లో బాక్టీరియా పెరుగుదలను నిరోధించిన KAND 11 యొక్క గాఢత, అరాబిడోప్సిస్‌లోని ప్రభావవంతమైన గాఢతకు సమానంగా ఉంది (పటం 5సి). ఈ ఫలితాలు KAND 11 వివిధ రకాల మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధించగలదని సూచిస్తున్నాయి. ఆ తర్వాత, మేము బేర్ మోనోఅమైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల యొక్క సాధ్యమయ్యే సైటోటాక్సిసిటీని ఇతర జీవులలో, అంటే వరుసగా ఉన్నత జంతు మరియు బాక్టీరియా కణాలకు ప్రతినిధులుగా ఉన్న మానవ హీలా కణాలు మరియు ఎస్చెరిచియా కోలి స్ట్రెయిన్ DH5α లలో పరిశోధించాము. వరుస కణ విస్తరణ పరీక్షలలో, కౌమామోనామైడ్ 1, కౌమామోనామైడిక్ యాసిడ్ 6, మరియు KAND 11 లు 100 μM గాఢతలలో హీలా లేదా E. కోలి కణాల పెరుగుదలను ప్రభావితం చేయలేదని మేము గమనించాము (పటం 5డి,ఇ).
అరబిడోప్సిస్ కాని జీవులలో KAND 11 యొక్క పెరుగుదల నిరోధం. (ఎ) రెండు వారాల వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ SR-1 పొగాకు మొలకలను 25 μM KAND 11 కలిగిన నిలువుగా ఉంచిన MS ప్లేట్లపై పెంచారు. (బి) రెండు వారాల వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ SR-1 పొగాకు మొలకలను 200 μM KAND 11 కలిగిన అడ్డంగా ఉంచిన MS ప్లేట్లపై పెంచారు. (సి) రెండు వారాల వయస్సు గల వైల్డ్-టైప్ Tak-1 లివర్‌వోర్ట్ మొగ్గలను, సూచించిన KAND 11 గాఢతలతో గాంబోర్గ్ B5 ప్లేట్లపై పెంచారు. రెండు వారాల ఇంక్యుబేషన్ కాలంలో పెరుగుదల ఆగిపోయిన బీజాలను ఎర్ర బాణాలు సూచిస్తున్నాయి. (డి) హీలా కణాల కణ విస్తరణ పరీక్ష. జీవకణాల సంఖ్యను నిర్ణీత సమయ వ్యవధులలో సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి కొలిచారు. నియంత్రణగా, హీలా కణాలకు 5 μg/ml యాక్టినోమైసిన్ D (Act D) తో చికిత్స చేశారు, ఇది RNA పాలిమరేస్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నిరోధించి కణ మరణానికి కారణమవుతుంది. విశ్లేషణలు మూడుసార్లు నిర్వహించబడ్డాయి. (ఇ) E. కోలి కణ విస్తరణ పరీక్ష. OD600ను కొలవడం ద్వారా E. కోలి పెరుగుదలను విశ్లేషించారు. నియంత్రణగా, బ్యాక్టీరియా కణ గోడ సంశ్లేషణను నిరోధించే 50 μg/ml ఆంపిసిలిన్ (Amp)తో కణాలకు చికిత్స చేశారు. విశ్లేషణలు మూడుసార్లు నిర్వహించబడ్డాయి.
యురామైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల వల్ల కలిగే కణవిషప్రభావం యొక్క చర్య విధానాన్ని విశ్లేషించడానికి, మేము మితమైన నిరోధక ప్రభావాలు కలిగిన అర్బెనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను తిరిగి విశ్లేషించాము, ఇది చిత్రంలో చూపబడింది. చిత్రాలు 2b, 6a లో చూపిన విధంగా, అధిక సాంద్రతలలో (200 μM) అర్మోటోనిక్ ఆమ్లం 6 కలిగిన అగార్ ప్లేట్లపై పెరిగిన మొలకలు పొట్టిగా మరియు ఎడమవైపు వంగిన వేర్లను (θ = – 23.7 ± 6.1) ఉత్పత్తి చేశాయి, అయితే నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకలు దాదాపుగా నిటారుగా ఉండే వేర్లను (θ = – 3.8 ± 7.1) ఉత్పత్తి చేశాయి. ఈ లక్షణమైన ఏటవాలు పెరుగుదల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క పనిచేయకపోవడం వల్ల సంభవిస్తుందని తెలుసు¹⁴,¹⁸. ఈ పరిశోధనకు అనుగుణంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే మందులైన డైసోపైరమైడ్ మరియు ఒరైజాలిన్ మా పెరుగుదల పరిస్థితులలో ఇలాంటి వేరు వంపును ప్రేరేపించాయి (చిత్రాలు 2b, 6a). అదే సమయంలో, మేము ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను పరీక్షించి, వాటిలో కొన్నింటిని ఎంచుకున్నాము, అవి నిర్దిష్ట గాఢతలలో ఏటవాలుగా వేరు పెరుగుదలను ప్రేరేపించాయి. సమ్మేళనాలు 8, 9, మరియు 15 వరుసగా 75 μM, 50 μM, మరియు 40 μM వద్ద వేరు పెరుగుదల దిశను మార్చాయి, ఇది ఈ సమ్మేళనాలు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను సమర్థవంతంగా అస్థిరపరచగలవని సూచిస్తుంది (పటం 2బి, 6ఎ). మేము అత్యంత శక్తివంతమైన ఉర్సోలిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నమైన KAND 11ను తక్కువ గాఢతలో (15 µM) కూడా పరీక్షించాము మరియు KAND 11 వాడకం వేరు పెరుగుదలను నిరోధించిందని, మరియు వేరు పెరుగుదల దిశ అసమానంగా ఉందని, అవి ఎడమ వైపుకు వాలడానికి మొగ్గు చూపాయని కనుగొన్నాము (పటం C3). మైక్రోట్యూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే మందుల అధిక గాఢతలు కొన్నిసార్లు వేరు వంగడానికి కారణం కాకుండా మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయి కాబట్టి, మేము తదనంతరం వేరు బాహ్యచర్మ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను పరిశీలించడం ద్వారా KAND 11 మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే అవకాశాన్ని అంచనా వేశాము. 25 μM KAND 11 తో చికిత్స పొందిన మొలక వేర్ల యొక్క బాహ్యచర్మ కణాలలో యాంటీ-β-ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి చేసిన ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ, పొడిగింపు మండలంలోని బాహ్యచర్మ కణాలలో దాదాపు అన్ని కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ అదృశ్యమైనట్లు చూపించింది (Fig. 6b). ఈ ఫలితాలు కుమామోటోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి వాటిపై ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా పనిచేస్తాయని మరియు ఈ సమ్మేళనాలు నూతన మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాలు అని సూచిస్తున్నాయి.
అర్సోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు అరాబిడోప్సిస్ థాలియానాలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను మారుస్తాయి. (ఎ) సూచించిన గాఢతలలో వివిధ అర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాల సమక్షంలో కొలిచిన వేరు వంపు కోణం. మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను నిరోధించే రెండు సమ్మేళనాలైన డైసోపైరమైడ్ మరియు ఒరైజాలిన్ ప్రభావాలను కూడా విశ్లేషించారు. వేరు పెరుగుదల కోణాన్ని కొలవడానికి ఉపయోగించిన ప్రమాణాన్ని ఇన్సెట్ చూపిస్తుంది. షామ్ ట్రీట్‌మెంట్‌తో గణనీయమైన తేడాలను ఆస్టరిస్క్‌లు సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p).< 0.05). n>19. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ. (బి) దీర్ఘీకరణ మండలంలోని బాహ్యచర్మ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్. 25 μM KAND 11 తో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్లపై పెరిగిన వైల్డ్-టైప్ అరాబిడోప్సిస్ కోల్ వేర్లలోని మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను, β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీస్ మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్-కాన్జుగేటెడ్ సెకండరీ యాంటీబాడీస్‌ను ఉపయోగించి ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ ద్వారా దృశ్యమానం చేశారు. స్కేల్ బార్ = 10 µm. (సి) వేరు మెరిస్టెమ్‌లోని మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క మైటోటిక్ నిర్మాణం. ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్‌ను ఉపయోగించి మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను దృశ్యమానం చేశారు. ప్రోఫేజ్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్మోప్లాస్ట్‌లతో సహా మైటోటిక్ నిర్మాణాలను కాన్ఫోకల్ చిత్రాల నుండి లెక్కించారు. బాణాలు మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి. నక్షత్ర గుర్తులు షామ్ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p).< 0.05). n>9. స్కేల్ బార్ = 50 µm.
ఉర్సాకు మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరుకు అంతరాయం కలిగించే సామర్థ్యం ఉన్నప్పటికీ, దాని చర్య విధానం సాధారణ మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపాలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల కంటే భిన్నంగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు. ఉదాహరణకు, డైసోపైరమైడ్ మరియు ఒరైజాలిన్ వంటి మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపాలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల అధిక గాఢతలు బాహ్యచర్మ కణాల అనిసోట్రోపిక్ విస్తరణను ప్రేరేపిస్తాయి, అయితే KAND 11 అలా చేయదు. అదనంగా, KAND 11 మరియు డైసోపైరమైడ్‌లను కలిపి ప్రయోగించినప్పుడు, డైసోపైరమైడ్-ప్రేరిత వేరు పెరుగుదల ప్రతిస్పందన మరియు KAND 11-ప్రేరిత పెరుగుదల నిరోధం రెండూ గమనించబడ్డాయి (పటం S4). మేము KAND 11కు హైపర్సెన్సిటివ్ డైసోపైరమైడ్ 1-1 (phs1-1) మ్యూటెంట్ యొక్క ప్రతిస్పందనను కూడా విశ్లేషించాము. phs1-1లో ఒక నాన్-కానానికల్ ట్యూబులిన్ కైనేస్ పాయింట్ మ్యూటేషన్ ఉంది మరియు ఇది డైసోపైరమైడ్‌తో చికిత్స చేసినప్పుడు పొట్టి వేర్లను ఉత్పత్తి చేస్తుంది9,20. KAND 11 కలిగిన అగార్ మాధ్యమంలో పెరిగిన phs1-1 మ్యూటెంట్ మొలకలు, డైసోపైరమైడ్‌పై పెరిగిన వాటి మాదిరిగానే పొట్టి వేర్లను కలిగి ఉన్నాయి (పటం S5).
అదనంగా, KAND 11 తో చికిత్స పొందిన మొలకల వేరు మెరిస్టెమ్‌లో ప్రోఫేజ్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్మోప్లాస్ట్‌ల వంటి మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిర్మాణాలను మేము గమనించాము. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS కోసం చేసిన పరిశీలనలకు అనుగుణంగా, మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ సంఖ్యలో గణనీయమైన తగ్గుదల గమనించబడింది (Fig. .6c).
ఉపకణ స్థాయిలో KAND 11 యొక్క కణవిషత్వాన్ని వర్గీకరించడానికి, మేము పొగాకు BY-2 సస్పెన్షన్ కణాలకు KAND 11 తో చికిత్స చేసి, వాటి ప్రతిస్పందనను గమనించాము. కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై KAND 11 ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, మేము మొదట మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేసే TagRFP-TUA6 ను వ్యక్తీకరించే BY-2 కణాలకు KAND 11 ను జోడించాము. కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ సాంద్రతను ఇమేజ్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి అంచనా వేశారు, ఇది సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలెటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించింది. ఈ పరీక్ష ఫలితాలు 50 μM లేదా 100 μM KAND 11 తో 1 గంట పాటు చికిత్స చేసిన తర్వాత, సాంద్రత వరుసగా 0.94 ± 0.74% లేదా 0.23 ± 0.28% కు గణనీయంగా తగ్గిందని చూపించాయి, అయితే DMSO తో చికిత్స పొందిన కణాల సాంద్రత 1.61 ± 0.34% గా ఉంది (Fig. 7a). ఈ ఫలితాలు అరాబిడోప్సిస్‌లో గమనించిన దానికి అనుగుణంగా ఉన్నాయి, KAND 11 చికిత్స కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క డిపాలిమరైజేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది (Fig. 6b). మేము అదే గాఢత గల KAND 11 తో చికిత్స చేసిన తర్వాత GFP-ABD-లేబుల్ చేయబడిన యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లతో BY-2 లైన్‌ను కూడా పరిశీలించాము మరియు KAND 11 చికిత్స యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను విచ్ఛిన్నం చేసిందని గమనించాము. 1 గంట పాటు 50 μM లేదా 100 μM KAND 11 తో చికిత్స చేయడం వల్ల యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ సాంద్రత వరుసగా 1.20 ± 0.62% లేదా 0.61 ± 0.26% కి గణనీయంగా తగ్గింది, అయితే DMSO-చికిత్స పొందిన కణాలలో సాంద్రత 1.69 ± 0.51% గా ఉంది (Fig. 2). 7b). ఈ ఫలితాలు యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను ప్రభావితం చేయని ప్రొపైజామైడ్ మరియు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయని యాక్టిన్ డిపాలిమరైజర్ అయిన లాట్రంకులిన్ B ప్రభావాలకు విరుద్ధంగా ఉన్నాయి (SI చిత్రం S6). అదనంగా, కౌమామోనామైడ్ 1, కౌమామోనామైడ్ ఆమ్లం 6, లేదా KAND 11 తో చికిత్స హీలా కణాలలో మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయలేదు (SI చిత్రం S7). అందువల్ల, KAND 11 యొక్క చర్య విధానం తెలిసిన సైటోస్కెలెటన్ డిస్రప్టర్‌ల చర్య విధానానికి భిన్నంగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు. అదనంగా, KAND 11 తో చికిత్స పొందిన BY-2 కణాలపై మా సూక్ష్మదర్శిని పరిశీలన, KAND 11 చికిత్స సమయంలో కణ మరణం ప్రారంభమవడాన్ని వెల్లడించింది మరియు 30 నిమిషాల KAND 11 చికిత్స తర్వాత ఇవాన్స్ బ్లూతో రంగు వేయబడిన మృత కణాల నిష్పత్తి గణనీయంగా పెరగలేదని చూపించింది, అయితే 50 μM లేదా 100 μM KAND తో 90 నిమిషాల చికిత్స తర్వాత, మృత కణాల సంఖ్య వరుసగా 43.7% లేదా 80.1% కి పెరిగింది (చిత్రం 7c). ఈ డేటా మొత్తం మీద, నూతన ఉర్సోలిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నమైన KAND 11 అనేది ఇంతకు ముందు తెలియని చర్య విధానంతో కూడిన ఒక మొక్క-నిర్దిష్ట సైటోస్కెలెటల్ నిరోధకం అని సూచిస్తుంది.
KAND పొగాకు BY-2 కణాలలోని కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్, యాక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ మరియు జీవశక్తిని ప్రభావితం చేస్తుంది. (ఎ) TagRFP-TUA6 సమక్షంలో BY-2 కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క దృశ్యీకరణ. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSO తో చికిత్స పొందిన BY-2 కణాలను కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు. 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ సాంద్రతను లెక్కించారు. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టూకీ HSD పరీక్ష, p< 0.05). స్కేల్ బార్ = 10 µm. (b) GFP-ABD2 సమక్షంలో BY-2 కణాలలో కార్టికల్ యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSO తో చికిత్స పొందిన BY-2 కణాలను కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు. 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి కార్టికల్ యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ల సాంద్రతను లెక్కించారు. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టూకీ HSD పరీక్ష, p< 0.05). స్కేల్ బార్ = 10 µm. (సి) ఇవాన్స్ బ్లూ స్టెయినింగ్ ద్వారా చనిపోయిన BY-2 కణాల పరిశీలన. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSO తో ట్రీట్ చేయబడిన BY-2 కణాలను బ్రైట్-ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు. n=3. స్కేల్ బార్ = 100 µm.
కొత్త సహజ ఉత్పత్తుల ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం వైద్యం మరియు వ్యవసాయంతో సహా మానవ జీవితంలోని వివిధ అంశాలలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీసింది. సహజ వనరుల నుండి ఉపయోగకరమైన సమ్మేళనాలను పొందడానికి చారిత్రాత్మక పరిశోధనలు జరిగాయి. ముఖ్యంగా, ఆక్టినోమైసెట్‌లు నెమటోడ్‌లకు పరాన్నజీవి నిరోధక యాంటీబయాటిక్స్‌గా ఉపయోగపడతాయని అంటారు. ఎందుకంటే ఇవి ఐవర్‌మెక్టిన్ యొక్క ప్రధాన సమ్మేళనమైన అవెర్మెక్టిన్, మరియు క్యాన్సర్ నిరోధక ఏజెంట్‌గా వైద్యపరంగా ఉపయోగించే బ్లియోమైసిన్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల వంటి వివిధ ద్వితీయ జీవక్రియలను ఉత్పత్తి చేయగలవు21,22. అదేవిధంగా, ఆక్టినోమైసెట్‌ల నుండి అనేక రకాల కలుపు సంహారక సమ్మేళనాలు కనుగొనబడ్డాయి, వాటిలో కొన్ని ఇప్పటికే వాణిజ్యపరంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి1,23. అందువల్ల, కావలసిన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో సహజ ఉత్పత్తులను వేరుచేయడానికి ఆక్టినోమైసెట్ జీవక్రియల విశ్లేషణ ఒక ప్రభావవంతమైన వ్యూహంగా పరిగణించబడుతుంది. ఈ అధ్యయనంలో, మేము S. werraensis నుండి కౌమామోనామైడ్ అనే కొత్త సమ్మేళనాన్ని కనుగొని, దానిని విజయవంతంగా సంశ్లేషణ చేసాము. ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం అనేది అర్బెనామైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క ఒక సంశ్లేషణ మధ్యస్థం. ఇది వేర్లు విలక్షణంగా ముడుచుకుపోవడానికి కారణమవుతుంది, మధ్యస్థం నుండి బలమైన కలుపు సంహారక చర్యను ప్రదర్శిస్తుంది, మరియు ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను దెబ్బతీస్తుంది. అయితే, ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్య విధానం ఇప్పటికే ఉన్న మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాల చర్య విధానానికి భిన్నంగా ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే KAND 11 యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను కూడా విచ్ఛిన్నం చేసి కణ మరణానికి కారణమవుతుంది. ఇది, ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు విస్తృత శ్రేణి సైటోస్కెలెటల్ నిర్మాణాలను ప్రభావితం చేసే ఒక నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తుంది.
అర్బెనోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్యా విధానాన్ని మరింత బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, దాని గురించి మరింత వివరంగా చేసే లక్షణ నిర్ధారణ సహాయపడుతుంది. ముఖ్యంగా, తదుపరి లక్ష్యం ఏమిటంటే, క్షీణించిన మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌కు బంధించగల అర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడం. తద్వారా అర్సోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు నేరుగా మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై పనిచేసి వాటిని విచ్ఛిన్నం చేస్తాయా, లేదా వాటి చర్య మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ అస్థిరతకు దారితీస్తుందా అని నిర్ధారించవచ్చు. అదనంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ ప్రత్యక్ష లక్ష్యం కాని సందర్భంలో, మొక్కల కణాలపై అర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్యా స్థానాన్ని మరియు అణు లక్ష్యాలను గుర్తించడం, సంబంధిత సమ్మేళనాల లక్షణాలను మరియు కలుపు సంహారక చర్యను మెరుగుపరిచే సాధ్యమైన మార్గాలను మరింతగా అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది. మా జీవక్రియాశీలత పరీక్షలో, అరాబిడోప్సిస్ థాలియానా, పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్ వంటి మొక్కల పెరుగుదలపై అర్సోనిక్ ఆమ్లానికి ప్రత్యేకమైన కణవిష సామర్థ్యం ఉన్నట్లు వెల్లడైంది, అయితే E. కోలి లేదా హీలా కణాలు ప్రభావితం కాలేదు. బహిరంగ వ్యవసాయ క్షేత్రాలలో ఉపయోగించే కలుపు సంహారకాలుగా అర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను అభివృద్ధి చేస్తే, జంతు కణాలపై వాటి విష ప్రభావం తక్కువగా లేదా అస్సలు లేకపోవడం ఒక ప్రయోజనం. నిజానికి, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యూకారియోట్స్‌లో సాధారణ నిర్మాణాలు కాబట్టి, మొక్కలలో వాటిని ప్రత్యేకంగా నిరోధించడం కలుపు సంహారకాలకు ఒక ముఖ్యమైన అవసరం. ఉదాహరణకు, ట్యూబులిన్‌కు నేరుగా బంధించి పాలిమరైజేషన్‌ను నిరోధించే మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపాలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ అయిన ప్రోపైజామైడ్, జంతు కణాలపై దాని తక్కువ విషపూరితత కారణంగా కలుపు సంహారిణిగా ఉపయోగించబడుతుంది24. డైసోపైరమైడ్‌కు భిన్నంగా, సంబంధిత బెంజమైడ్‌లు వేర్వేరు లక్ష్య నిర్దిష్టతలను కలిగి ఉంటాయి. మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌తో పాటు, RH-4032 లేదా బెంజోక్సామైడ్ వరుసగా జంతు కణాలు లేదా ఊమైసెట్‌ల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను కూడా నిరోధిస్తాయి, మరియు జాలిలామైడ్ దాని తక్కువ ఫైటోటాక్సిసిటీ కారణంగా శిలీంధ్రనాశకంగా ఉపయోగించబడుతుంది25,26,27. కొత్తగా కనుగొనబడిన బేర్ మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మొక్కలపై ఎంపిక చేసిన సైటోటాక్సిసిటీని ప్రదర్శిస్తాయి, కానీ గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, మరిన్ని మార్పులు వాటి లక్ష్య నిర్దిష్టతను మార్చవచ్చు, తద్వారా వ్యాధికారక శిలీంధ్రాలు లేదా ఊమైసెట్‌ల నియంత్రణకు అదనపు ఉత్పన్నాలను అందించే అవకాశం ఉంది.
అర్బెనోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క విశిష్ట లక్షణాలు, వాటిని కలుపు సంహారకాలుగా అభివృద్ధి చేయడానికి మరియు పరిశోధన సాధనాలుగా ఉపయోగించడానికి ఉపయోగపడతాయి. మొక్క కణ ఆకారాన్ని నియంత్రించడంలో కణ అస్థిపంజరం యొక్క ప్రాముఖ్యత విస్తృతంగా గుర్తించబడింది. రూపాంతరీకరణను సరిగ్గా నియంత్రించడానికి, మొక్కలు మైక్రోట్యూబ్యూల్ గతిశాస్త్రాన్ని నియంత్రించడం ద్వారా కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ వ్యవస్థీకరణ యొక్క సంక్లిష్ట యంత్రాంగాలను అభివృద్ధి చేసుకున్నాయని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి. మైక్రోట్యూబ్యూల్ కార్యకలాపాల నియంత్రణకు బాధ్యత వహించే పెద్ద సంఖ్యలో అణువులు గుర్తించబడ్డాయి, మరియు సంబంధిత పరిశోధన ఇప్పటికీ కొనసాగుతోంది3,4,28. మొక్క కణాలలో మైక్రోట్యూబ్యూల్ గతిశాస్త్రంపై మన ప్రస్తుత అవగాహన, కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ వ్యవస్థీకరణ యొక్క యంత్రాంగాలను పూర్తిగా వివరించదు. ఉదాహరణకు, డైసోపైరమైడ్ మరియు ఒరైజాలిన్ రెండూ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను విచ్ఛిన్నం చేయగలిగినప్పటికీ, డైసోపైరమైడ్ తీవ్రమైన వేరు వక్రీకరణకు కారణమవుతుంది, అయితే ఒరైజాలిన్ సాపేక్షంగా తేలికపాటి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది. అంతేకాకుండా, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను స్థిరీకరించే ట్యూబులిన్‌లోని ఉత్పరివర్తనలు వేర్లలో డెక్స్ట్రోరొటేషన్‌కు కూడా కారణమవుతాయి, అయితే మైక్రోట్యూబ్యూల్ గతిశాస్త్రాన్ని స్థిరీకరించే పాక్లిటాక్సెల్ అలా చేయదు. అందువల్ల, ఉర్సోలిక్ ఆమ్లం యొక్క అణు లక్ష్యాలను అధ్యయనం చేసి, గుర్తించడం ద్వారా మొక్కల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ నియంత్రణపై కొత్త అంతర్దృష్టులు లభిస్తాయి. అదేవిధంగా, డైసోపైరమైడ్ వంటి వక్రీకృత పెరుగుదలను ప్రోత్సహించడంలో ప్రభావవంతమైన రసాయనాలను, ఒరైజాలిన్ లేదా కుమామోటోరిక్ ఆమ్లం వంటి తక్కువ ప్రభావవంతమైన రసాయనాలతో భవిష్యత్తులో పోల్చడం ద్వారా వక్రీకృత పెరుగుదల ఎలా సంభవిస్తుందనే దానిపై ఆధారాలు లభిస్తాయి.
మరోవైపు, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క కణవిషత్వాన్ని వివరించడానికి రక్షణ సంబంధిత కణ అస్థిపంజర పునర్వ్యవస్థీకరణలు మరొక అవకాశం. ఒక వ్యాధికారక క్రిమి సంక్రమణ లేదా మొక్క కణాలలోకి ఒక ప్రేరకం ప్రవేశపెట్టడం కొన్నిసార్లు కణ అస్థిపంజరం నాశనానికి మరియు తదనంతర కణ మరణానికి కారణమవుతుంది29. ఉదాహరణకు, ఊమైసీట్ నుండి లభించే క్రిప్టోక్సాంథిన్, పొగాకు కణ మరణానికి ముందు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మరియు యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను దెబ్బతీస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది KAND చికిత్సతో జరిగే దానికి సమానంగా ఉంటుంది30,31. రక్షణ ప్రతిస్పందనలు మరియు ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం ద్వారా ప్రేరేపించబడిన కణ ప్రతిస్పందనల మధ్య ఉన్న సారూప్యతలు, అవి ఉమ్మడి కణ ప్రక్రియలను ప్రేరేపిస్తాయని మనం ఊహించడానికి దారితీశాయి, అయినప్పటికీ క్రిప్టోక్సాంథిన్ కంటే ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క వేగవంతమైన మరియు బలమైన ప్రభావం స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది. అయితే, యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ల అంతరాయం ఆకస్మిక కణ మరణాన్ని ప్రోత్సహిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది ఎల్లప్పుడూ మైక్రోట్యూబ్యూల్ అంతరాయంతో కూడి ఉండదు29. అదనంగా, ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు చేసే విధంగా, వ్యాధికారక క్రిమి లేదా ప్రేరకం వక్రీకరించిన వేరు పెరుగుదలకు కారణమవుతాయో లేదో చూడాల్సి ఉంది. అందువల్ల, రక్షణ ప్రతిస్పందనలను మరియు సైటోస్కెలెటన్‌ను అనుసంధానించే అణు సంబంధిత జ్ఞానం అనేది పరిష్కరించాల్సిన ఒక ఆకర్షణీయమైన సమస్య. ఉర్సోనిక్ ఆమ్లానికి సంబంధించిన తక్కువ అణుభారం గల సమ్మేళనాల ఉనికిని, అలాగే విభిన్న సామర్థ్యాలు గల అనేక ఉత్పన్నాలను ఉపయోగించుకోవడం ద్వారా, తెలియని కణ యంత్రాంగాలను లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి అవి అవకాశాలను అందించవచ్చు.
మొత్తంగా చూస్తే, మైక్రోట్యూబ్యూల్ గతిశీలతను నియంత్రించే కొత్త సమ్మేళనాల ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం, మొక్క కణ ఆకృతి నిర్ధారణకు ఆధారమైన సంక్లిష్ట అణు యంత్రాంగాలను పరిష్కరించడానికి శక్తివంతమైన పద్ధతులను అందిస్తాయి. ఈ సందర్భంలో, ఇటీవల అభివృద్ధి చేయబడిన అర్మోటోనిక్ ఆమ్లం అనే సమ్మేళనం, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మరియు యాక్టిన్ ఫిలమెంట్లను ప్రభావితం చేసి కణ మరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది మైక్రోట్యూబ్యూల్ నియంత్రణ మరియు ఈ ఇతర యంత్రాంగాల మధ్య ఉన్న సంబంధాన్ని విడదీయడానికి ఒక అవకాశాన్ని అందించవచ్చు. అందువల్ల, అర్బెనోనిక్ ఆమ్లాన్ని ఉపయోగించి చేసే రసాయన మరియు జీవశాస్త్ర విశ్లేషణ, మొక్క సైటోస్కెలెటన్‌ను నియంత్రించే అణు నియంత్రణ యంత్రాంగాలను అర్థం చేసుకోవడానికి మనకు సహాయపడుతుంది.
డీయోనైజ్డ్ నీటిలో 2% (w/v) గెలాక్టోస్, 2% (w/v) ఎసెన్స్ పేస్ట్, 1% (w/v) బాక్టో కంపోజిషన్-సోయ్‌టన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, ఇంక్.), 0.5% (w/v) కార్న్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ (కోగోస్ట్‌చ్ కో., లిమిటెడ్, జపాన్), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 మరియు 0.2% CaCO3 కలిగిన 110 mL సీడ్ మీడియం ఉన్న 500 mL బాఫిల్డ్ ఎర్లెన్‌మేయర్ ఫ్లాస్క్‌లోకి S. werraensis MK493-CF1ను ఇనాక్యులేట్ చేయండి. (స్టెరిలైజేషన్‌కు ముందు pH 7.4). సీడ్ కల్చర్‌లను 27°C వద్ద 2 రోజుల పాటు రోటరీ షేకర్ (180 rpm) మీద ఇంక్యుబేట్ చేశారు. సాలిడ్ స్టేట్ ఫెర్మెంటేషన్ ద్వారా ఉత్పత్తి పెంపకం. 15 గ్రాముల నొక్కిన బార్లీ (MUSO Co., Ltd., జపాన్) మరియు 25 గ్రాముల డీయోనైజ్డ్ నీరు (స్టెరిలైజేషన్‌కు ముందు pH సర్దుబాటు చేయబడలేదు) కలిగిన 40 గ్రాముల ఉత్పత్తి మాధ్యమం ఉన్న 500 ml K-1 ఫ్లాస్క్‌లోకి సీడ్ కల్చర్ (7 ml)ను బదిలీ చేశారు. కిణ్వ ప్రక్రియను 30°C వద్ద చీకటిలో 14 రోజుల పాటు నిర్వహించారు. కిణ్వ ప్రక్రియ పదార్థాన్ని 40 ml/సీసా EtOHతో సంగ్రహించి, సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు (1500 g, 4°C, 10 నిమిషాలు). కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ (60 ml)ను 10% MeOH/EtOAc మిశ్రమంతో సంగ్రహించారు. సేంద్రీయ పొరను తగ్గించిన పీడనం వద్ద ఆవిరి చేసి ఒక అవశేషాన్ని (59.5 మి.గ్రా) పొందారు, దీనిని రివర్స్ ఫేజ్ కాలమ్ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × పొడవు 250 mm) పై గ్రేడియంట్ ఎల్యూషన్ (0–10 నిమిషాలు: 90%) తో HPLC కి గురిచేయగా, 1.5 మి.లీ/నిమిషం ప్రవాహ రేటు వద్ద H2O/CH3CN, 10–35 నిమిషాలు: 90% H2O/CH3CN నుండి 70% H2O/CH3CN (గ్రేడియంట్), 35–45 నిమిషాలు: 90% H2O/EtOH, 45–155 నిమిషాలు: 90% H2O/EtOH నుండి 100% EtOH (గ్రేడియంట్), 155–200 నిమిషాలు: 100% EtOH) ను ప్రయోగించారు. దీని ఫలితంగా కౌమామోనామైడ్ (1, 36.0 మి.గ్రా) ను తెల్లటి నిరాకార పొడిగా వేరుచేయబడింది.
కుమామోటోమైడ్(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ లెక్కించిన విలువ: 141.0659, కొలిచిన విలువ: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
కొలంబియా విత్తనాలను (Col-0) అరబిడోప్సిస్ బయోలాజికల్ రిసోర్స్ సెంటర్ (ABRC) నుండి పరిశోధన ఉపయోగం కోసం అనుమతితో పొందడం జరిగింది. Col-0 విత్తనాలను మా ప్రయోగశాల పరిస్థితులలో ప్రవర్ధనం చేసి, సంరక్షించి, వైల్డ్-టైప్ అరబిడోప్సిస్ మొక్కలుగా ఉపయోగించడం జరిగింది. అరబిడోప్సిస్ విత్తనాలను ఉపరితల స్టెరిలైజేషన్ చేసి, 2% సుక్రోజ్ (ఫ్యూజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), 0.05% (w/v) 2-(4-మార్ఫోలినో)ఇథేన్‌సల్ఫోనిక్ ఆమ్లం (MES) (ఫ్యూజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) మరియు 1.5% అగర్ (ఫ్యూజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), pH 5.7 కలిగిన సగం-బలం గల మురాషిగే మరియు స్కూగ్ మీడియంలో, 23 °C వద్ద మరియు స్థిరమైన కాంతిలో కల్చర్ చేయడం జరిగింది. phs1-1 మ్యూటెంట్ యొక్క విత్తనాలను టి. హషిమోటో (నారా ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు.
SR-1 రకం విత్తనాలను టి. హషిమోటో (నారా ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు మరియు వాటిని వైల్డ్-టైప్ పొగాకు మొక్కలుగా ఉపయోగించారు. పొగాకు విత్తనాలను ఉపరితలంపై క్రిమిరహితం చేసి, మొలకెత్తడాన్ని ప్రోత్సహించడానికి మూడు రాత్రుల పాటు క్రిమిరహిత నీటిలో నానబెట్టారు. ఆ తర్వాత, వాటిని 2% సుక్రోజ్, 0.05% (w/v) MES, మరియు 0.8% జెల్లాన్ గమ్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) మురాషిగే మరియు స్కూగ్ మీడియం) కలిగిన సగం గాఢత గల ద్రావణంలో (pH 5.7 వద్ద) ఉంచి, స్థిరమైన కాంతిలో 23°C వద్ద పొదిగారు.
టాక్-1 స్ట్రెయిన్‌ను టి. కోచి (క్యోటో విశ్వవిద్యాలయం) అందించారు మరియు దీనిని లివర్‌వోర్ట్ అధ్యయనం కోసం ప్రామాణిక ప్రయోగాత్మక యూనిట్‌గా ఉపయోగించారు. క్రిమిరహితం చేసిన సాగు మొక్కల నుండి జెమ్మాను సేకరించి, ఆ తర్వాత 1% సుక్రోజ్ మరియు 0.3% జెల్లాన్ గమ్ కలిగిన గాంబోర్గ్ బి5 మీడియం (ఫ్యూజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) పై ప్లేట్ చేసి, నిరంతర కాంతిలో 23°C వద్ద ఇంక్యుబేట్ చేశారు.
పొగాకు BY-2 కణాలను (నికోటియానా టాబాకమ్ ఎల్. సివి. బ్రైట్ ఎల్లో 2) ఎస్. హసేజావా (టోక్యో విశ్వవిద్యాలయం) అందించారు. BY-2 కణాలను మాడిఫైడ్ లిన్స్‌మీయర్ మరియు స్కూగ్ మీడియంలో 95 రెట్లు పలుచగా చేసి, ప్రతి వారం 2,4-డైక్లోరోఫినాక్సియాసిటిక్ ఆమ్లం 32 తో అనుబంధంగా చేర్చారు. కణ సస్పెన్షన్‌ను చీకటిలో 27°C వద్ద 130 rpm వేగంతో రోటరీ షేకర్‌పై కలిపారు. కణాలను 10 రెట్లు పరిమాణంలో తాజా మీడియంతో కడిగి, అదే మీడియంలో తిరిగి సస్పెండ్ చేయండి. క్యాలీఫ్లవర్ మొజాయిక్ వైరస్ 35S ప్రమోటర్ కింద మైక్రోట్యూబ్యూల్ మార్కర్ TagRFP-TUA6 లేదా యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ మార్కర్ GFP-ABD2 ను స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే BY-2 ట్రాన్స్‌జెనిక్ కణ శ్రేణులను వివరించిన విధంగా 33,34,35 ఉత్పత్తి చేశారు. ఈ కణ శ్రేణులను అసలైన BY-2 కణ శ్రేణికి ఉపయోగించిన పద్ధతుల మాదిరిగానే నిర్వహించవచ్చు మరియు సమకాలీకరించవచ్చు.
HeLa కణాలను 37°C ఇంక్యుబేటర్‌లో 5% CO2 వద్ద, 10% ఫీటల్ బోవైన్ సీరం, 1.2 U/ml పెన్సిలిన్, మరియు 1.2 μg/ml స్ట్రెప్టోమైసిన్‌తో అనుబంధంగా ఉన్న డల్బెక్కోస్ మాడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియం (DMEM) (లైఫ్ టెక్నాలజీస్)లో కల్చర్ చేశారు.
ఈ పత్రంలో వివరించిన ప్రయోగాలన్నీ జపనీస్ జీవభద్రతా నిబంధనలు మరియు మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి.
సమ్మేళనాలను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO; ఫ్యూజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్)లో స్టాక్ ద్రావణాలుగా కరిగించి, అరాబిడోప్సిస్ మరియు పొగాకు కోసం MS మాధ్యమంలో లేదా లివర్‌వోర్ట్ కోసం గాంబోర్గ్ B5 మాధ్యమంలో పలుచబరిచారు. వేరు పెరుగుదల నిరోధక పరీక్ష కోసం, సూచించిన సమ్మేళనాలు లేదా DMSO కలిగిన అగార్ మాధ్యమంపై ఒక్కో ప్లేటుకు 10 కంటే ఎక్కువ విత్తనాలను నాటారు. విత్తనాలను 7 రోజుల పాటు గ్రోత్ ఛాంబర్‌లో పొదిగారు. మొలకలను ఫోటో తీసి, వేర్ల పొడవును కొలిచారు. అరాబిడోప్సిస్ మొలకెత్తే పరీక్ష కోసం, 200 μM సమ్మేళనం లేదా DMSO కలిగిన అగార్ మాధ్యమంపై ఒక్కో ప్లేటుకు 48 విత్తనాలను నాటారు. అరాబిడోప్సిస్ విత్తనాలను గ్రోత్ ఛాంబర్‌లో పెంచి, మొలకెత్తిన 7 రోజుల తర్వాత (dag) మొలకెత్తిన మొలకల సంఖ్యను లెక్కించారు. పొగాకు మొలకెత్తే పరీక్ష కోసం, 200 μM KAND లేదా DMSO కలిగిన అగార్ మాధ్యమంపై ఒక్కో ప్లేటుకు 24 విత్తనాలను నాటారు. పొగాకు విత్తనాలను గ్రోత్ ఛాంబర్‌లో పెంచి, 14 రోజుల తర్వాత మొలకెత్తిన నారుమొక్కల సంఖ్యను లెక్కించారు. లివర్‌వోర్ట్ పెరుగుదల నిరోధక పరీక్ష కోసం, ప్రతి ప్లేట్ నుండి 9 పిండాలను, సూచించిన గాఢతలలో KAND లేదా DMSO కలిగిన అగర్ మాధ్యమంపై ఉంచి, 14 రోజుల పాటు గ్రోత్ ఛాంబర్‌లో పొదిగారు.
వేరు మెరిస్టెమ్ నిర్మాణాన్ని దృశ్యమానం చేయడానికి 5 mg/ml ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI) తో రంగు వేసిన మొలకలను ఉపయోగించండి. TCS SPE కాన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లీకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా PI సంకేతాలను గమనించారు.
మలామి మరియు బెన్‌ఫే36 వివరించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం β-గ్లూకురోనిడేస్ (GUS) తో వేర్ల హిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ నిర్వహించబడింది. మొలకలను రాత్రిపూట 90% అసిటోన్‌లో స్థిరీకరించారు, GUS బఫర్‌లో 0.5 mg/ml 5-బ్రోమో-4-క్లోరో-3-ఇండోలిల్-β-d-గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లంతో 1 గంట పాటు స్టెయిన్ చేసి, హైడ్రేటెడ్ క్లోరాల్డిహైడ్ ద్రావణంలో (8 గ్రా క్లోరల్ హైడ్రేట్, 2 ml నీరు మరియు 1 ml గ్లిసరాల్) ఉంచారు మరియు యాక్సియో ఇమేజర్ M1 మైక్రోస్కోప్ (కార్ల్ జీస్) ఉపయోగించి డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫెరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు.
నిలువుగా ఉంచిన ప్లేట్లపై పెరిగిన 7 రోజుల వయస్సు గల మొలకల వేరు కోణాలను కొలిచారు. 6వ దశలో వివరించిన విధంగా గురుత్వాకర్షణ వెక్టర్ దిశ నుండి వేరు కోణాన్ని కొలవండి.
ప్రోటోకాల్ 37 కు చిన్న మార్పులతో, వివరించిన విధంగా కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క అమరికను గమనించారు. యాంటీ-β-ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీ (KMX-1, మెర్క్ మిల్లిపోర్: MAB3408) మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్ 488-కాన్జుగేటెడ్ యాంటీ-మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A32723) లను వరుసగా 1:1000 మరియు 1:100 పలుచనలలో ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ యాంటీబాడీలుగా ఉపయోగించారు. ఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలను TCS SPE కాన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లీకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి పొందారు. తయారీదారు సూచనల ప్రకారం Z-స్టాక్ చిత్రాలను పొందండి మరియు గరిష్ట తీవ్రత ప్రొజెక్షన్‌లను సృష్టించండి.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి హీలా కణాల వృద్ధి పరీక్షను నిర్వహించారు.
600 nm (OD600) వద్ద స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్‌ను ఉపయోగించి కల్చర్‌లో కణ సాంద్రతను కొలవడం ద్వారా E. coli DH5α పెరుగుదలను విశ్లేషించారు.
CSU-X1 కాన్ఫోకల్ స్కానింగ్ పరికరం (యోకోగావా) మరియు sCMOS కెమెరా (జైలా, ఆండర్ టెక్నాలజీ) అమర్చిన ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్‌ను ఉపయోగించి ట్రాన్స్‌జెనిక్ BY-2 కణాలలో సైటోస్కెలెటల్ ఆర్గనైజేషన్‌ను గమనించారు. వివరించిన విధంగా ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి కాన్ఫోకల్ చిత్రాలలో సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలెటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించే ఇమేజ్ విశ్లేషణ ద్వారా సైటోస్కెలెటల్ సాంద్రతను అంచనా వేశారు38,39.
BY-2 కణాలలో కణ మరణాన్ని గుర్తించడానికి, కణ సస్పెన్షన్ యొక్క కొంత భాగాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 0.05% ఇవాన్స్ బ్లూతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మృత కణాలకు ఇవాన్స్ బ్లూతో ప్రత్యేకంగా రంగు వేయడం అనేది, చెక్కుచెదరని ప్లాస్మా పొర ద్వారా జీవించి ఉన్న కణాల నుండి రంగు పదార్థం బయటకు నెట్టబడటంపై ఆధారపడి ఉంటుంది40. రంగు వేయబడిన కణాలను బ్రైట్-ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోప్ (BX53, ఒలింపస్) ఉపయోగించి పరిశీలించారు.
HeLa కణాలను 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద తేమతో కూడిన ఇంక్యుబేటర్‌లో 10% FBS కలిపిన DMEMలో పెంచారు. కణాలకు 37°C వద్ద 6 గంటల పాటు 100 μM KAND 11, కుమామోనామిక్ ఆమ్లం 6, కుమామోనామైడ్ 1, 100 ng/ml కోల్సెమిడ్ (గిబ్కో), లేదా 100 ng/ml నోకోడ్‌మేజ్ (సిగ్మా)తో చికిత్స చేశారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద కణాలను 10 నిమిషాల పాటు MetOHతో, ఆపై 5 నిమిషాల పాటు అసిటేట్‌తో స్థిరీకరించారు. స్థిరీకరించిన కణాలను 0.5% BSA/PBSలో పలుచన చేసిన β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ (1D4A4, ప్రోటీన్‌టెక్: 66240-1)తో 2 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, TBSTతో 3 సార్లు కడిగి, ఆపై అలెక్సా ఫ్లోర్ మేక యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 488 1 గంట. – మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A11001) మరియు 15 ng/ml 4′,6-డయామిడినో-2-ఫెనిలిండోల్ (DAPI) లను 0.5% BSA/PBS లో విలీనం చేశారు. TBST తో మూడుసార్లు కడిగిన తర్వాత, రంగు వేయబడిన కణాలను నికాన్ ఎక్లిప్స్ Ti-E ఇన్వర్టెడ్ మైక్రోస్కోప్‌పై పరిశీలించారు. మెటామార్ఫ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (మాలిక్యులర్ డివైసెస్) ఉపయోగించి, కూల్డ్ హమామాట్సు ORCA-R2 CCD కెమెరాతో చిత్రాలను సంగ్రహించారు.