మొక్కల మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే నవల మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాలుగా ఉర్సా మోనోఅమైడ్‌ల ఆవిష్కరణ, క్యారెక్టరైజేషన్ మరియు ఫంక్షనల్ మెరుగుదల.

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ సంస్కరణకు పరిమిత CSS మద్దతు ఉంది.ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, మీరు మీ బ్రౌజర్ యొక్క క్రొత్త సంస్కరణను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).ఈ సమయంలో, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైలింగ్ లేదా జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతున్నాము.
సహజ ఉత్పత్తుల యొక్క ఆవిష్కరణ మరియు ప్రయోజనకరమైన ఉపయోగం మానవ జీవితాన్ని మెరుగుపరచడంలో సహాయపడుతుంది.కలుపు మొక్కలను నియంత్రించడానికి మొక్కల పెరుగుదల నిరోధక రసాయనాలను హెర్బిసైడ్లుగా విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తున్నారు.వివిధ రకాల హెర్బిసైడ్లను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం ఉన్నందున, చర్య యొక్క కొత్త విధానాలతో సమ్మేళనాలను గుర్తించాల్సిన అవసరం ఉంది.ఈ అధ్యయనంలో, మేము స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రాయెన్సిస్ MK493-CF1 నుండి N-alkoxypyrrole సమ్మేళనం, కూమమోనామైడ్ అనే నవలని కనుగొన్నాము మరియు పూర్తి సంశ్లేషణ ప్రక్రియను స్థాపించాము.జీవసంబంధ కార్యాచరణ పరీక్షల ద్వారా, ఉర్స్-మోనోఅమిక్ యాసిడ్ అనేది ఉర్స్-మోనోఅమైడ్ యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్ మరియు సంభావ్యత అని మేము కనుగొన్నాముమొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం.అదనంగా, మేము హెలా కణాల పెరుగుదలను ప్రతికూలంగా ప్రభావితం చేయకుండా అధిక హెర్బిసైడ్ చర్యను కలిగి ఉన్న urbenyloxy డెరివేటివ్ (UDA)తో సహా వివిధ అర్బెనోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌లను అభివృద్ధి చేసాము.ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలు మొక్కల మైక్రోటూబ్యూల్స్‌కు అంతరాయం కలిగిస్తాయని కూడా మేము కనుగొన్నాము;అదనంగా, KAND యాక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను ప్రభావితం చేస్తుంది మరియు కణాల మరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది;ఈ బహుముఖ ప్రభావాలు తెలిసిన మైక్రోటూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్‌ల నుండి భిన్నంగా ఉంటాయి మరియు కొత్త హెర్బిసైడ్‌ల అభివృద్ధిలో ముఖ్యమైన ప్రయోజనాన్ని సూచించే ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ చర్య యొక్క కొత్త విధానాన్ని సూచిస్తాయి.
ప్రయోజనకరమైన సహజ ఉత్పత్తులు మరియు వాటి ఉత్పన్నాల యొక్క ఆవిష్కరణ మరియు ఆచరణాత్మక అనువర్తనం మానవ జీవన నాణ్యతను మెరుగుపరిచే సాధనం.సూక్ష్మజీవులు, మొక్కలు మరియు కీటకాలచే ఉత్పత్తి చేయబడిన ద్వితీయ జీవక్రియలు ఔషధం మరియు వ్యవసాయంలో ప్రధాన పురోగతికి దారితీశాయి.అనేక యాంటీబయాటిక్స్ మరియు యాంటీ లుకేమియా మందులు సహజ ఉత్పత్తుల నుండి అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి.అదనంగా, వివిధ రకాలపురుగుమందులు, వ్యవసాయంలో ఉపయోగం కోసం ఈ సహజ ఉత్పత్తుల నుండి శిలీంధ్రాలు మరియు కలుపు సంహారకాలు సంగ్రహించబడతాయి.ప్రత్యేకించి, కలుపు నియంత్రణ కలుపు సంహారకాలు ఆధునిక వ్యవసాయంలో పంట దిగుబడిని పెంచడానికి ముఖ్యమైన సాధనాలు మరియు వివిధ రకాల సమ్మేళనాలు ఇప్పటికే వాణిజ్యపరంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి.కిరణజన్య సంయోగక్రియ, అమైనో ఆమ్ల జీవక్రియ, సెల్ గోడ సంశ్లేషణ, మైటోసిస్ నియంత్రణ, ఫైటోహార్మోన్ సిగ్నలింగ్ లేదా ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ వంటి మొక్కలలోని అనేక సెల్యులార్ ప్రక్రియలు హెర్బిసైడ్‌ల యొక్క సాధారణ లక్ష్యాలుగా పరిగణించబడతాయి.మైక్రోటూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించే సమ్మేళనాలు మిటోటిక్ నియంత్రణను ప్రభావితం చేయడం ద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను ప్రభావితం చేసే హెర్బిసైడ్‌ల యొక్క సాధారణ తరగతి.
మైక్రోటూబ్యూల్స్ సైటోస్కెలిటన్ యొక్క భాగాలు మరియు యూకారియోటిక్ కణాలలో విస్తృతంగా సంరక్షించబడతాయి.ట్యూబులిన్ హెటెరోడైమర్‌లో α-ట్యూబులిన్ మరియు β-ట్యూబులిన్‌లు లీనియర్ మైక్రోటూబ్యూల్ ప్రోటోఫిలమెంట్‌లను ఏర్పరుస్తాయి, 13 ప్రోటోఫిలమెంట్‌లు స్థూపాకార నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తాయి.కణ ఆకృతి, కణ విభజన మరియు కణాంతర రవాణాతో సహా మొక్కల కణాలలో మైక్రోటూబ్యూల్స్ బహుళ పాత్రలను పోషిస్తాయి.మొక్కల కణాలు ఇంటర్‌ఫేస్ ప్లాస్మా పొర క్రింద మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను కలిగి ఉంటాయి మరియు ఇవి కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ అని పిలవబడే సెల్యులోజ్ సింథేస్ కాంప్లెక్స్‌ల నియంత్రణ ద్వారా సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబ్రిల్స్ సంస్థను నియంత్రిస్తాయి.రూట్ ఎపిడెర్మల్ కణాల యొక్క కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్, రూట్ టిప్ యొక్క వేగవంతమైన పొడిగింపు జోన్‌లో ఉన్నాయి, ఇవి పార్శ్వంగా ఉంటాయి మరియు సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబర్‌లు ఈ మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను అనుసరిస్తాయి మరియు సెల్ విస్తరణ దిశను పరిమితం చేస్తాయి, తద్వారా అనిసోట్రోపిక్ సెల్ పొడిగింపును ప్రోత్సహిస్తుంది.అందువల్ల, మైక్రోటూబ్యూల్ ఫంక్షన్ మొక్కల స్వరూపంతో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.ట్యూబులిన్‌ను ఎన్‌కోడింగ్ చేసే జన్యువులలోని అమైనో యాసిడ్ ప్రత్యామ్నాయాలు కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్ శ్రేణుల వక్రీకరణకు మరియు అరబిడోప్సిస్ 6,7లో ఎడమ లేదా కుడి వైపు పెరుగుదలకు కారణమవుతాయి.అదేవిధంగా, మైక్రోటూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను నియంత్రించే మైక్రోటూబ్యూల్-అనుబంధ ప్రోటీన్‌లలో ఉత్పరివర్తనలు కూడా వక్రీకరించిన రూట్ పెరుగుదలకు దారితీయవచ్చు8,9,10,11,12,13.అదనంగా, ప్రిటిలాక్లోర్ అని కూడా పిలువబడే డిసోపైరమైడ్ వంటి మైక్రోటూబ్యూల్-అంతరాయం కలిగించే హెర్బిసైడ్‌లతో చికిత్స ఎడమ వైపు వాలుగా ఉండే మూలాల పెరుగుదలకు కూడా కారణమవుతుంది.మొక్కల పెరుగుదల దిశను నిర్ణయించడానికి మైక్రోటూబ్యూల్ ఫంక్షన్ యొక్క ఖచ్చితమైన నియంత్రణ కీలకమని ఈ డేటా సూచిస్తుంది.
వివిధ రకాల మైక్రోటూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు కనుగొనబడ్డాయి మరియు ఈ మందులు సైటోస్కెలెటల్ పరిశోధనకు, అలాగే వ్యవసాయం మరియు వైద్యానికి గణనీయమైన కృషి చేశాయి.ప్రత్యేకించి, ఒరిజాలిన్, డైనిట్రోఅనిలిన్ సమ్మేళనాలు, డిస్పిరమైడ్, బెంజామైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాలు మరియు వాటి సారూప్యతలు మైక్రోటూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించగలవు మరియు తద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయి.అందువల్ల, వాటిని హెర్బిసైడ్లుగా విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తారు.అయినప్పటికీ, మైక్రోటూబ్యూల్స్ మొక్క మరియు జంతు కణాలలో ఒక ముఖ్యమైన భాగం కాబట్టి, చాలా మైక్రోటూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు రెండు కణాలకు సైటోటాక్సిక్‌గా ఉంటాయి.అందువల్ల, హెర్బిసైడ్లుగా గుర్తించబడిన ప్రయోజనం ఉన్నప్పటికీ, పరిమిత సంఖ్యలో యాంటీమైక్రోటూబ్యూల్ ఏజెంట్లు ఆచరణాత్మక ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగించబడతాయి.
స్ట్రెప్టోమైసెస్ అనేది స్ట్రెప్టోమైసెస్ కుటుంబానికి చెందిన ఒక జాతి, ఇందులో ఏరోబిక్, గ్రామ్-పాజిటివ్, ఫిలమెంటస్ బాక్టీరియా ఉన్నాయి మరియు విస్తృత శ్రేణి ద్వితీయ జీవక్రియలను ఉత్పత్తి చేసే సామర్థ్యానికి విస్తృతంగా ప్రసిద్ది చెందింది.అందువల్ల, ఇది కొత్త జీవశాస్త్రపరంగా క్రియాశీలక సహజ ఉత్పత్తుల యొక్క అత్యంత ముఖ్యమైన వనరులలో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది.ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, మేము కమామోనమైడ్ అనే కొత్త సమ్మేళనాన్ని కనుగొన్నాము, ఇది స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రాయెన్సిస్ MK493-CF1 మరియు S. వెరారెన్సిస్ ISP 5486 నుండి వేరుచేయబడింది. వర్ణపట విశ్లేషణ మరియు పూర్తి వర్ణపట విశ్లేషణను ఉపయోగించి, coumamonamide యొక్క నిర్మాణం వర్గీకరించబడింది మరియు దాని ప్రత్యేక N-alkoxyelepyrr నిర్ణయించబడింది.సంశ్లేషణ.ఉర్స్మోనిక్ యాసిడ్, ఉర్స్మోనోఅమైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్, ప్రముఖ మోడల్ ప్లాంట్ అరబిడోప్సిస్ థాలియానా యొక్క పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిని నిరోధిస్తున్నట్లు కనుగొనబడింది.స్ట్రక్చర్-యాక్టివిటీ రిలేషన్ షిప్ స్టడీలో, ఉర్సోనిక్ యాసిడ్‌కి మార్చబడిన C9తో కూడిన సమ్మేళనం, నానిలోక్సీ డెరివేటివ్ ఆఫ్ ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ (KAND) అని పిలుస్తారు, ఇది పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిపై నిరోధక ప్రభావాన్ని గణనీయంగా పెంచుతుందని మేము కనుగొన్నాము.ముఖ్యంగా, కొత్తగా కనుగొన్న మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్‌ల పెరుగుదలను కూడా ప్రభావితం చేసింది మరియు బ్యాక్టీరియా లేదా హెలా కణాలకు సైటోటాక్సిక్ కాదు.అంతేకాకుండా, కొన్ని ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌లు వక్రీకరించిన రూట్ ఫినోటైప్‌ను ప్రేరేపిస్తాయి, ఈ ఉత్పన్నాలు ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయని సూచిస్తున్నాయి.ఈ ఆలోచనకు అనుగుణంగా, ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్‌గా లేదా ఫ్లోరోసెంట్ ప్రొటీన్‌లతో లేబుల్ చేయబడిన మైక్రోటూబ్యూల్స్ యొక్క మా పరిశీలనలు KAND చికిత్స మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను డిపోలిమరైజ్ చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.అదనంగా, కుమామోటోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌లతో చికిత్స యాక్టిన్ మైక్రోఫిలమెంట్‌లకు అంతరాయం కలిగించింది.ఈ విధంగా, మేము కొత్త మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాన్ని కనుగొన్నాము, దీని ప్రత్యేకమైన చర్యలో సైటోస్కెలిటన్ నాశనం ఉంటుంది.
స్ట్రెయిన్ MK493-CF1 టోక్యోలోని షినగావా-కులోని మట్టి నుండి వేరుచేయబడింది.స్ట్రెయిన్ MK493-CF1 బాగా బ్రాంచ్డ్ స్ట్రోమల్ మైసిలియంను ఏర్పరుస్తుంది.16S రైబోసోమల్ RNA జన్యువు (1422 bp) యొక్క పాక్షిక క్రమం నిర్ణయించబడింది.ఈ జాతి S. వెర్రెన్సిస్‌తో సమానంగా ఉంటుంది (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: సాధారణ జాతి, 99.93%).ఈ ఫలితం ఆధారంగా, ఈ జాతి S. వెర్రెన్సిస్ రకం జాతికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉందని నిర్ధారించబడింది.కాబట్టి, మేము ఈ జాతికి తాత్కాలికంగా S. వెరారెన్సిస్ MK493-CF1 అని పేరు పెట్టాము.S. werraensis ISP 5486T కూడా అదే బయోయాక్టివ్ సమ్మేళనాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.ఈ సూక్ష్మజీవి నుండి సహజ ఉత్పత్తులను పొందడంపై తక్కువ ప్రారంభ పరిశోధనలు జరిగాయి కాబట్టి, తదుపరి రసాయన పరిశోధనలు జరిగాయి.14 రోజుల పాటు 30°C వద్ద ఘన-స్థితి కిణ్వ ప్రక్రియ ద్వారా బార్లీ మాధ్యమంలో S. వెర్రెన్సిస్ MK493-CF1ని సాగు చేసిన తర్వాత, మాధ్యమం 50% EtOHతో సంగ్రహించబడింది.59.5 mg ముడి సారాన్ని పొందేందుకు 60 ml నమూనాను ఎండబెట్టారు.ముడి సారం N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide పేరు, 36.0 mg) ఇవ్వడానికి HPLC రివర్స్ ఫేజ్‌కు లోబడి ఉంది.1 యొక్క మొత్తం మొత్తం ముడి సారంలో సుమారు 60%.అందువల్ల, కుమామోటోమైడ్ 1 యొక్క లక్షణాలను వివరంగా అధ్యయనం చేయాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.
Coumamonamide 1 అనేది తెల్లని నిరాకార పొడి మరియు అధిక రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (HRESIMS) C6H8N2O2 (Fig. 1)ని నిర్ధారిస్తుంది.ఈ సమ్మేళనం యొక్క C2-ప్రత్యామ్నాయ పైరోల్ భాగం δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR 5 వర్ణపటంలో δH: 4.4. , H-5) మరియు δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), మరియు 13C NMR స్పెక్ట్రం నాలుగు sp2 కార్బన్ అణువుల ఉనికిని చూపుతుంది.C2 స్థానం వద్ద అమైడ్ సమూహం యొక్క ఉనికిని C-3 ప్రోటాన్ నుండి δC 161.1 వద్ద అమైడ్ కార్బొనిల్ కార్బన్‌కు HMBC సహసంబంధం ద్వారా అంచనా వేయబడింది.అదనంగా, δH 4.10 (3H, S) మరియు δC 68.3 వద్ద 1 H మరియు 13 C NMR శిఖరాలు అణువులో N-మెథాక్సీ సమూహాల ఉనికిని సూచిస్తాయి.మెరుగైన వ్యత్యాస స్పెక్ట్రోస్కోపీ మరియు న్యూక్లియర్ ఓవర్‌హౌజర్ సంక్షిప్తీకరణ (NOEDF) వంటి స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి మెథాక్సీ సమూహం యొక్క సరైన స్థానం ఇంకా నిర్ణయించబడనప్పటికీ, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide మొదటి అభ్యర్థి సమ్మేళనం అయింది.
1 యొక్క సరైన నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడానికి, మొత్తం సంశ్లేషణ జరిగింది (Fig. 2a).m-CPBAతో వాణిజ్యపరంగా లభించే 2-అమినోపైరిడిన్ 2 చికిత్స పరిమాణాత్మక దిగుబడిలో సంబంధిత N-ఆక్సైడ్ 3కి దారితీసింది.2 యొక్క 2-అమినోఅజిడేషన్ తర్వాత, అబ్రమోవిచ్ వివరించిన సైక్లోకండెన్సేషన్ ప్రతిచర్య గ్రాములలో కావలసిన 1-హైడ్రాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బోనిట్రైల్ 5ని పొందేందుకు 90°C వద్ద బెంజీన్‌లో నిర్వహించబడింది.వేగం 60% (రెండు దశలు).15,16.4 యొక్క మిథైలేషన్ మరియు జలవిశ్లేషణ తరువాత 1-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సిలిక్ యాసిడ్ ("క్యుమోటోనిక్ యాసిడ్" అని పిలుస్తారు, 6) మంచి దిగుబడి (70%, రెండు దశలు) ఇచ్చింది.చివరగా, సజల అమ్మోనియాను ఉపయోగించి యాసిడ్ క్లోరైడ్ ఇంటర్మీడియట్ 6 ద్వారా అమిడేషన్ 98% దిగుబడిలో కుమామోటో అమైడ్ 1ని ఇచ్చింది.సంశ్లేషణ చేయబడిన 1 యొక్క అన్ని స్పెక్ట్రల్ డేటా వివిక్త 1ని పోలి ఉంటుంది, కాబట్టి 1 యొక్క నిర్మాణం నిర్ణయించబడింది;
ఉర్బెనామైడ్ మరియు అర్బెనిక్ యాసిడ్ యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాల సాధారణ సంశ్లేషణ మరియు విశ్లేషణ.(ఎ) కుమామోటో అమైడ్ యొక్క మొత్తం సంశ్లేషణ.(బి) ఏడు రోజుల వయస్సు గల అరబిడోప్సిస్ కొలంబియా (కల్) మొలకలని మురాషిగే మరియు స్కూగ్ (MS) ప్లేట్లలో కూమమోనమైడ్ 6 లేదా కౌమమోనమైడ్ 1ని సూచించిన సాంద్రతలలో పెంచారు.స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ.
మొదట, మొక్కల పెరుగుదలను మాడ్యులేట్ చేయగల సామర్థ్యం కోసం మేము అర్బెనామైడ్ మరియు దాని మధ్యవర్తుల యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను అంచనా వేసాము.మేము MS అగర్ మాధ్యమానికి ఉర్స్మోనామైడ్ 1 లేదా ఉర్స్మోనిక్ యాసిడ్ 6 యొక్క వివిధ సాంద్రతలను జోడించాము మరియు ఈ మాధ్యమంలో కల్చర్డ్ అరబిడోప్సిస్ థాలియానా మొలకలను జోడించాము.6 యొక్క అధిక సాంద్రతలు (500 μM) రూట్ పెరుగుదలను నిరోధించాయని ఈ పరీక్షలు చూపించాయి (Fig. 2b).తరువాత, మేము 6 యొక్క N1 స్థానాన్ని భర్తీ చేయడం ద్వారా వివిధ ఉత్పన్నాలను రూపొందించాము మరియు వాటిపై నిర్మాణ-కార్యకలాప సంబంధ అధ్యయనాలను నిర్వహించాము (అనలాగ్ సంశ్లేషణ ప్రక్రియ సపోర్టింగ్ ఇన్ఫర్మేషన్ (SI)లో వివరించబడింది).అరబిడోప్సిస్ మొలకలని 50 μM ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌లను కలిగి ఉన్న మాధ్యమంలో పెంచారు మరియు రూట్ పొడవును కొలుస్తారు.చిత్రంలో చూపిన విధంగా.గణాంకాలు 3a, b మరియు S1లో చూపినట్లుగా, కౌమామో యాసిడ్‌లు N1 స్థానం వద్ద వివిధ పొడవు గల లీనియర్ ఆల్కాక్సీ చైన్‌లు (9, 10, 11, 12, మరియు 13) లేదా పెద్ద ఆల్కాక్సీ చైన్‌లను (15, 16, మరియు 17) కలిగి ఉంటాయి.ఉత్పన్నాలు రూట్ పెరుగుదల యొక్క గణనీయమైన నిరోధాన్ని చూపించాయి.అదనంగా, మేము 200 μM 10, 11, లేదా 17 అంకురోత్పత్తిని నిరోధించడాన్ని కనుగొన్నాము (Fig. 3c మరియు S2).
కుమామోటో అమైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాల నిర్మాణం-కార్యాచరణ సంబంధంపై అధ్యయనం.(a) అనలాగ్‌ల నిర్మాణం మరియు సంశ్లేషణ పథకం.(బి) 50 μM కూమమోనామైడ్ ఉత్పన్నాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో పెరిగిన 7-రోజుల వయస్సు గల మొలకల మూల పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ.ఆస్టరిస్క్‌లు షామ్ ట్రీట్‌మెంట్‌తో ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t టెస్ట్, p<0.05).n>18. డేటా సగటు ± SDగా చూపబడింది.nt అంటే "పరీక్షించబడలేదు" ఎందుకంటే 50% కంటే ఎక్కువ విత్తనాలు మొలకెత్తలేదు.(సి) 200 μM కౌమామోనమైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో 7 రోజులు పొదిగిన చికిత్స చేసిన విత్తనాల అంకురోత్పత్తి రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ.ఆస్టరిస్క్‌లు షామ్ ట్రీట్‌మెంట్ (చి-స్క్వేర్ టెస్ట్)తో ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి.n=96.
ఆసక్తికరంగా, C9 కంటే పొడవైన ఆల్కైల్ సైడ్ చెయిన్‌ల జోడింపు నిరోధక చర్యను తగ్గించింది, కుమామోటోయిక్ యాసిడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాలకు వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రదర్శించడానికి నిర్దిష్ట పరిమాణంలోని సైడ్ చెయిన్‌లు అవసరమని సూచిస్తున్నాయి.
స్ట్రక్చర్-యాక్టివిటీ రిలేషన్షిప్ విశ్లేషణ C9 ఉర్సోనిక్ యాసిడ్‌గా మార్చబడిందని మరియు ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ యొక్క నానిలోక్సీ ఉత్పన్నం (ఇకపై KAND 11గా సూచిస్తారు) అత్యంత ప్రభావవంతమైన మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం అని చూపించినందున, మేము KAND 11 యొక్క మరింత వివరణాత్మక లక్షణాన్ని నిర్వహించాము. అరబిడోప్సిస్ చికిత్స 50 μM KAND 11 అంకురోత్పత్తిని దాదాపు పూర్తిగా నిరోధించింది, అయితే KAND 11 యొక్క తక్కువ సాంద్రతలు (40, 30, 20, లేదా 10 μM) మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో రూట్ పెరుగుదలను నిరోధించాయి (Fig. 4a, b).KAND 11 రూట్ మెరిస్టెమ్ ఎబిబిలిటీని ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI)తో తడిసిన రూట్ మెరిస్టెమ్‌లను పరిశీలించాము మరియు మెరిస్టెమ్ ఏరియా పరిమాణాన్ని కొలిచాము.25 μM KAND-11 కలిగిన మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 151.1 ± 32.5 μm, అయితే DMSO కలిగిన నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, , ఇది KAND-11 సెల్యులార్ కార్యాచరణను పునరుద్ధరిస్తుందని సూచిస్తుంది.వ్యాపించడం.రూట్ మెరిస్టెమ్.దీనికి అనుగుణంగా, KAND 11 చికిత్స రూట్ మెరిస్టెమ్ (Fig. 4e) 17లో సెల్ డివిజన్ మార్కర్ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS సిగ్నల్ మొత్తాన్ని తగ్గించింది.ఈ ఫలితాలు KAND 11 కణాల విస్తరణ కార్యకలాపాలను తగ్గించడం ద్వారా రూట్ పెరుగుదలను నిరోధిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
పెరుగుదలపై ఉర్బెనోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్స్ (అర్బెనిలోక్సీ డెరివేటివ్స్) యొక్క నిరోధక ప్రభావం యొక్క విశ్లేషణ.(a) KAND 11 యొక్క సూచించిన సాంద్రతలతో MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన 7-రోజుల వైల్డ్-టైప్ కోల్ మొలకల. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ.(బి) రూట్ పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ.అక్షరాలు ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p<0.05).n>16. డేటా సగటు ± SDగా చూపబడింది.(సి) 25 μM KANDతో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన ప్రొపిడియం అయోడైడ్-స్టెయిన్డ్ వైల్డ్-టైప్ కోల్ రూట్స్ యొక్క కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ 11. వైట్ బ్రాకెట్‌లు రూట్ మెరిస్టెమ్‌ను సూచిస్తాయి.స్కేల్ బార్ = 100 µm.(d) రూట్ మెరిస్టమ్ పరిమాణం యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 10 నుండి 11).టి-టెస్ట్ ఉపయోగించి గణాంక వ్యత్యాసాలు నిర్ణయించబడ్డాయి (p<0.05).బార్‌లు సగటు మెరిస్టెమ్ పరిమాణాన్ని సూచిస్తాయి.(ఇ) CDKB2 నిర్మాణాన్ని కలిగి ఉన్న రూట్ మెరిస్టెమ్ యొక్క డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ (DIC) మైక్రోస్కోపీ;1ప్రో: CDKB2;25 µM KAND పరీక్షతో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్లలో పెరిగిన 5-రోజుల వయస్సు గల మొలకలపై 1-GUS మరక మరియు మరక.
KAND 11 యొక్క ఫైటోటాక్సిసిటీని మరొక డైకోటిలెడోనస్ ప్లాంట్, పొగాకు (నికోటియానా టాబాకమ్) మరియు ఒక ప్రధాన భూమి మొక్కల నమూనా జీవి, లివర్‌వోర్ట్ (మార్చాంటియా పాలిమార్ఫా) ఉపయోగించి మరింత పరీక్షించబడింది.అరబిడోప్సిస్ విషయంలో వలె, 25 μM KAND 11 కలిగి ఉన్న మాధ్యమంలో పెరిగిన పొగాకు SR-1 మొలకలు తక్కువ మూలాలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి (Fig. 5a).అదనంగా, 48 విత్తనాలలో 40 200 μM KAND 11 కలిగిన ప్లేట్‌లపై మొలకెత్తాయి, అయితే మొత్తం 48 విత్తనాలు మాక్-ట్రీట్ చేయబడిన మాధ్యమంలో మొలకెత్తాయి, ఇది KAND యొక్క అధిక సాంద్రతలు ముఖ్యమైనవని సూచిస్తున్నాయి (p<0.05;చి టెస్ట్ -స్క్వేర్) పొగాకు అంకురోత్పత్తిని నిరోధిస్తుంది.(Fig. 5b).అదనంగా, లివర్‌వోర్ట్‌లో బ్యాక్టీరియా పెరుగుదలను నిరోధించే KAND 11 యొక్క గాఢత అరబిడోప్సిస్ (Fig. 5c)లో ప్రభావవంతమైన ఏకాగ్రతను పోలి ఉంటుంది.ఈ ఫలితాలు KAND 11 వివిధ రకాల మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధించగలవని సూచిస్తున్నాయి.మేము ఇతర జీవులలో బేర్ మోనోఅమైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని పరిశోధించాము, అవి మానవ హెలా కణాలు మరియు ఎస్చెరిచియా కోలి స్ట్రెయిన్ DH5α, వరుసగా అధిక జంతు మరియు బ్యాక్టీరియా కణాల ప్రతినిధులుగా.కణ విస్తరణ పరీక్షల శ్రేణిలో, 100 μM (Fig. 5d, e) సాంద్రతలలో హెలా లేదా E. కోలి కణాల పెరుగుదలను coumamonamide 1, coummonamidic యాసిడ్ 6 మరియు KAND 11 ప్రభావితం చేయలేదని మేము గమనించాము.
అరబిడోప్సిస్ కాని జీవులలో KAND 11 యొక్క పెరుగుదల నిరోధం.(ఎ) రెండు వారాల అడవి-రకం SR-1 పొగాకు మొలకలని నిలువుగా ఉంచిన MS ప్లేట్‌లపై 25 μM KAND 11తో పెంచారు. (b) రెండు వారాల అడవి-రకం SR-1 పొగాకు మొలకలని అడ్డంగా ఉంచారు. 200 μM KAND 11. (సి) KAND 11 యొక్క సూచించబడిన సాంద్రతలతో గాంబోర్గ్ B5 ప్లేట్‌లపై పెరిగిన రెండు వారాల వైల్డ్-టైప్ Tak-1 లివర్‌వోర్ట్ మొగ్గలు. ఎరుపు బాణాలు రెండు వారాల పొదిగే సమయంలో పెరగడం ఆగిపోయిన బీజాంశాలను సూచిస్తాయి. కాలం.(d) HeLa కణాల సెల్ విస్తరణ పరీక్ష.సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి స్థిర సమయ వ్యవధిలో ఆచరణీయ కణాల సంఖ్యను కొలుస్తారు.నియంత్రణగా, HeLa కణాలు 5 μg/ml ఆక్టినోమైసిన్ D (Act D)తో చికిత్స చేయబడ్డాయి, ఇది RNA పాలిమరేస్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది.మూడుసార్లు విశ్లేషణలు జరిగాయి.(ఇ) E. కోలి సెల్ విస్తరణ పరీక్ష.E. coli పెరుగుదల OD600ని కొలవడం ద్వారా విశ్లేషించబడింది.నియంత్రణగా, కణాలు 50 μg/ml యాంపిసిలిన్ (Amp)తో చికిత్స చేయబడ్డాయి, ఇది బ్యాక్టీరియా కణ గోడ సంశ్లేషణను నిరోధిస్తుంది.మూడుసార్లు విశ్లేషణలు జరిగాయి.
యురామైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల వల్ల కలిగే సైటోటాక్సిసిటీ చర్య యొక్క యంత్రాంగాన్ని అర్థంచేసుకోవడానికి, మేము మితమైన నిరోధక ప్రభావాలతో అర్బెనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలను తిరిగి విశ్లేషించాము.చిత్రంలో చూపిన విధంగా.గణాంకాలు 2b, 6aలో చూపినట్లుగా, ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ 6 యొక్క అధిక సాంద్రతలు (200 μM) కలిగిన అగర్ ప్లేట్‌లపై పెరిగిన మొలకలు చిన్న మరియు ఎడమ-వక్ర మూలాలను (θ = – 23.7 ± 6.1) ఉత్పత్తి చేస్తాయి, అయితే నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల, మొలకలు దాదాపు నేరుగా మూలాలను ఉత్పత్తి చేస్తాయి (θ = - 3.8 ± 7.1).ఈ విలక్షణమైన ఏటవాలు పెరుగుదల కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ 14,18 యొక్క పనిచేయకపోవడం వల్ల సంభవిస్తుంది.ఈ అన్వేషణకు అనుగుణంగా, మైక్రోటూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే డ్రగ్స్ డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ మా వృద్ధి పరిస్థితులలో ఒకే విధమైన రూట్ టిల్టింగ్‌ను ప్రేరేపించాయి (Fig. 2b, 6a).అదే సమయంలో, మేము ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌లను పరీక్షించాము మరియు వాటిలో కొన్నింటిని ఎంచుకున్నాము, అవి నిర్దిష్ట సాంద్రతలలో, వాలుగా ఉండే రూట్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించాయి.8, 9 మరియు 15 సమ్మేళనాలు వరుసగా 75 μM, 50 μM మరియు 40 μM వద్ద రూట్ పెరుగుదల దిశను మార్చాయి, ఈ సమ్మేళనాలు మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను సమర్థవంతంగా అస్థిరపరుస్తాయని సూచిస్తున్నాయి (Fig. 2b, 6a).మేము తక్కువ గాఢత (15 µM) వద్ద అత్యంత శక్తివంతమైన ఉర్సోలిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నమైన KAND 11ని కూడా పరీక్షించాము మరియు KAND 11 యొక్క అప్లికేషన్ మూలాల పెరుగుదలను నిరోధిస్తుందని మరియు రూట్ పెరుగుదల దిశ అసమానంగా ఉందని కనుగొన్నాము, అయినప్పటికీ అవి ఎడమ వైపుకు వాలుగా ఉంటాయి ( మూర్తి C3)..మైక్రోటూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే ఔషధాల యొక్క అధిక సాంద్రతలు కొన్నిసార్లు రూట్ టిల్టింగ్‌కు కారణం కాకుండా మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయి కాబట్టి, రూట్ ఎపిడెర్మల్ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను గమనించడం ద్వారా KAND 11 మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే అవకాశాన్ని మేము అంచనా వేసాము.25 μM KAND 11తో చికిత్స చేయబడిన మొలకల మూలాల ఎపిడెర్మల్ కణాలలో యాంటీ-β-ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ పొడుగు జోన్‌లోని ఎపిడెర్మల్ కణాలలో దాదాపు అన్ని కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ అదృశ్యమైనట్లు చూపించింది (Fig. 6b).ఈ ఫలితాలు కుమామోటోనిక్ యాసిడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మైక్రోటూబ్యూల్స్‌పై ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా పనిచేస్తాయని మరియు ఈ సమ్మేళనాలు నవల మైక్రోటూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్‌లు అని సూచిస్తున్నాయి.
అర్సోనిక్ యాసిడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాలు అరబిడోప్సిస్ థాలియానాలో కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను మారుస్తాయి.(ఎ) సూచించిన సాంద్రతలలో వివిధ ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్‌ల సమక్షంలో రూట్ వంపు కోణం కొలుస్తారు.మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను నిరోధించే రెండు సమ్మేళనాల ప్రభావాలు: డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ కూడా విశ్లేషించబడ్డాయి.ఇన్సెట్ రూట్ పెరుగుదల కోణాన్ని కొలవడానికి ఉపయోగించే ప్రమాణాన్ని చూపుతుంది.ఆస్టరిస్క్‌లు షామ్ ట్రీట్‌మెంట్‌తో ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t టెస్ట్, p<0.05).n>19. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ.(బి) పొడుగు జోన్‌లోని ఎపిడెర్మల్ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్.25 μM KAND 11తో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన వైల్డ్-టైప్ అరబిడోప్సిస్ కోల్ రూట్స్‌లోని మైక్రోటూబ్యూల్స్ β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీస్ మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్-కంజుగేటెడ్ సెకండరీ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించి ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ ద్వారా దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.స్కేల్ బార్ = 10 µm.(సి) రూట్ మెరిస్టెమ్‌లోని మైక్రోటూబ్యూల్స్ యొక్క మైటోటిక్ నిర్మాణం.ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ ఉపయోగించి మైక్రోటూబ్యూల్స్ దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.ప్రొఫేస్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్‌మోప్లాస్ట్‌లతో సహా మైటోటిక్ నిర్మాణాలు కన్ఫోకల్ చిత్రాల నుండి లెక్కించబడ్డాయి.బాణాలు మైటోటిక్ మైక్రోటూబ్యూల్ నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి.ఆస్టరిస్క్‌లు షామ్ ట్రీట్‌మెంట్‌తో ముఖ్యమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t టెస్ట్, p<0.05).n>9. స్కేల్ బార్ = 50 µm.
ఉర్సా మైక్రోటూబ్యూల్ పనితీరుకు అంతరాయం కలిగించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నప్పటికీ, దాని చర్య యొక్క విధానం సాధారణ మైక్రోటూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల నుండి భిన్నంగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు.ఉదాహరణకు, మైక్రోటూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల యొక్క అధిక సాంద్రతలు డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ వంటివి ఎపిడెర్మల్ కణాల యొక్క అనిసోట్రోపిక్ విస్తరణను ప్రేరేపిస్తాయి, అయితే KAND 11 అలా చేయదు.అదనంగా, KAND 11 మరియు డిసోపిరమైడ్ యొక్క సహ-అనువర్తనం ఫలితంగా కలిపి డిస్పిరమైడ్-ప్రేరిత రూట్ పెరుగుదల ప్రతిస్పందన ఏర్పడింది మరియు KAND 11-ప్రేరిత వృద్ధి నిరోధం గమనించబడింది (Fig. S4).మేము KAND 11కి మార్చబడిన హైపర్‌సెన్సిటివ్ డిసోపైరమైడ్ 1-1 (phs1-1) ప్రతిస్పందనను కూడా విశ్లేషించాము. phs1-1 నాన్-కానానికల్ ట్యూబులిన్ కినేస్ పాయింట్ మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉంది మరియు డిసోపైరమైడ్9,20తో చికిత్స చేసినప్పుడు తక్కువ మూలాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.phs1-1 KAND 11ని కలిగి ఉన్న అగర్ మాధ్యమంలో పెరిగిన ఉత్పరివర్తన మొలకలు డిస్‌పిరమిడ్ (అత్తి. S5)పై పెరిగిన వాటి వలె చిన్న మూలాలను కలిగి ఉంటాయి.
అదనంగా, KAND 11తో చికిత్స చేయబడిన మొలకల మూల మెరిస్టెమ్‌లో ప్రోఫేస్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్మోప్లాస్ట్‌లు వంటి మైటోటిక్ మైక్రోటూబ్యూల్ నిర్మాణాలను మేము గమనించాము. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS పరిశీలనలకు అనుగుణంగా, గణనీయంగా తగ్గింది. మైటోటిక్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ సంఖ్య గమనించబడింది (Fig. .6c).
సబ్ సెల్యులార్ రిజల్యూషన్ వద్ద KAND 11 యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని వర్గీకరించడానికి, మేము KAND 11తో పొగాకు BY-2 సస్పెన్షన్ కణాలకు చికిత్స చేసాము మరియు వాటి ప్రతిస్పందనను గమనించాము.కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్‌పై KAND 11 ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి మేము మొదట KAND 11ని BY-2 కణాలకు జోడించాము, ఇది TagRFP-TUA6ని వ్యక్తీకరిస్తుంది, ఇది మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ఫ్లోరోసెంట్‌గా లేబుల్ చేస్తుంది.చిత్ర విశ్లేషణను ఉపయోగించి కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్ సాంద్రత అంచనా వేయబడింది, ఇది సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలెటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించింది.1 గంటకు 50 μM లేదా 100 μM KAND 11తో చికిత్స చేసిన తర్వాత, సాంద్రత గణనీయంగా 0.94 ± 0.74% లేదా 0.23 ± 0.28%కి తగ్గిందని పరీక్ష ఫలితాలు చూపించాయి, అయితే DMSOతో చికిత్స చేయబడిన కణాల సాంద్రత .6 4.4 % (Fig. 7a).ఈ ఫలితాలు అరబిడోప్సిస్‌లోని పరిశీలనకు అనుగుణంగా ఉంటాయి, KAND 11 చికిత్స కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ యొక్క డిపోలిమరైజేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది (Fig. 6b).KAND 11 యొక్క అదే ఏకాగ్రతతో చికిత్స తర్వాత GFP-ABD-లేబుల్ చేయబడిన ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లతో BY-2 లైన్‌ను కూడా మేము పరిశీలించాము మరియు KAND 11 చికిత్స యాక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లకు అంతరాయం కలిగించిందని గమనించాము.1 గంటకు 50 μM లేదా 100 μM KAND 11తో చికిత్స యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ సాంద్రతను వరుసగా 1.20 ± 0.62% లేదా 0.61 ± 0.26%కి తగ్గించింది, అయితే DMSO-చికిత్స చేసిన కణాలలో సాంద్రత 1% ± 1.69).7b).ఈ ఫలితాలు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను ప్రభావితం చేయని ప్రొపైజామైడ్ మరియు మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయని లాట్‌రన్‌కులిన్ బి, ఆక్టిన్ డిపోలిమరైజర్ (SI Figure S6) ప్రభావాలతో విభేదిస్తాయి.అదనంగా, కౌమమోనమైడ్ 1, కూమమోనామైడ్ యాసిడ్ 6 లేదా KAND 11తో చికిత్స HeLa కణాలలో మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయలేదు (SI Figure S7).అందువల్ల, KAND 11 యొక్క చర్య యొక్క యంత్రాంగం తెలిసిన సైటోస్కెలిటన్ డిస్‌రప్టర్‌ల నుండి భిన్నంగా ఉంటుందని నమ్ముతారు.అదనంగా, KAND 11తో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాల యొక్క మా మైక్రోస్కోపిక్ పరిశీలన KAND 11 చికిత్స సమయంలో సెల్ డెత్ ప్రారంభాన్ని వెల్లడించింది మరియు 30 నిమిషాల KAND 11 చికిత్స తర్వాత ఎవాన్స్ బ్లూ-స్టెయిన్డ్ డెడ్ సెల్స్ నిష్పత్తి గణనీయంగా పెరగలేదని చూపించింది. 50 μM లేదా 100 μM KANDతో 90 నిమిషాల చికిత్స తర్వాత, చనిపోయిన కణాల సంఖ్య వరుసగా 43.7% లేదా 80.1%కి పెరిగింది (Fig. 7c).కలిసి చూస్తే, ఈ డేటా నవల ఉర్సోలిక్ యాసిడ్ డెరివేటివ్ KAND 11 అనేది మునుపు తెలియని చర్యతో కూడిన మొక్క-నిర్దిష్ట సైటోస్కెలెటల్ ఇన్హిబిటర్ అని సూచిస్తుంది.
KAND కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్, ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ మరియు పొగాకు BY-2 కణాల సాధ్యతను ప్రభావితం చేస్తుంది.(ఎ) TagRFP-TUA6 సమక్షంలో BY-2 కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ యొక్క విజువలైజేషన్.KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSOతో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలు కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించబడ్డాయి.కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్ సాంద్రత 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి లెక్కించబడుతుంది.అక్షరాలు ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p<0.05).స్కేల్ బార్ = 10 µm.(బి) BY-2 కణాలలో కార్టికల్ ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ GFP-ABD2 సమక్షంలో దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSOతో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలు కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించబడ్డాయి.కార్టికల్ ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ యొక్క సాంద్రత 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి లెక్కించబడుతుంది.అక్షరాలు ముఖ్యమైన వ్యత్యాసాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p<0.05).స్కేల్ బార్ = 10 µm.(సి) ఎవాన్స్ బ్లూ స్టెయినింగ్ ద్వారా చనిపోయిన BY-2 కణాల పరిశీలన.KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSOతో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలు బ్రైట్-ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించబడ్డాయి.n=3.స్కేల్ బార్ = 100 µm.
కొత్త సహజ ఉత్పత్తుల యొక్క ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం ఔషధం మరియు వ్యవసాయంతో సహా మానవ జీవితంలోని వివిధ అంశాలలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీసింది.సహజ వనరుల నుండి ఉపయోగకరమైన సమ్మేళనాలను పొందేందుకు చారిత్రక పరిశోధనలు జరిగాయి.ప్రత్యేకించి, ఆక్టినోమైసెట్‌లు నెమటోడ్‌లకు యాంటీపరాసిటిక్ యాంటీబయాటిక్‌లుగా ఉపయోగపడతాయి, ఎందుకంటే అవి అవెర్‌మెక్టిన్, ఐవర్‌మెక్టిన్ మరియు బ్లీమైసిన్ యొక్క ప్రధాన సమ్మేళనం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు వంటి వివిధ ద్వితీయ జీవక్రియలను ఉత్పత్తి చేయగల సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి.అదేవిధంగా, ఆక్టినోమైసెట్స్ నుండి అనేక రకాల హెర్బిసైడ్ సమ్మేళనాలు కనుగొనబడ్డాయి, వాటిలో కొన్ని ఇప్పటికే వాణిజ్యపరంగా 1,23 ఉపయోగించబడుతున్నాయి.అందువల్ల, కావలసిన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో సహజ ఉత్పత్తులను వేరుచేయడానికి ఆక్టినోమైసెట్ మెటాబోలైట్ల విశ్లేషణ సమర్థవంతమైన వ్యూహంగా పరిగణించబడుతుంది.ఈ అధ్యయనంలో, మేము S. వెరారెన్సిస్ నుండి కొత్త సమ్మేళనం, కూమమోనామైడ్‌ను కనుగొన్నాము మరియు దానిని విజయవంతంగా సంశ్లేషణ చేసాము.ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ అనేది అర్బెనామైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్.ఇది లక్షణమైన రూట్ కర్లింగ్‌కు కారణమవుతుంది, మోస్తరు నుండి బలమైన హెర్బిసైడ్ చర్యను ప్రదర్శిస్తుంది మరియు మొక్కల సూక్ష్మనాళికలను ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా దెబ్బతీస్తుంది.అయినప్పటికీ, ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ చర్య యొక్క మెకానిజం ఇప్పటికే ఉన్న మైక్రోటూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్‌ల నుండి భిన్నంగా ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే KAND 11 కూడా యాక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లకు అంతరాయం కలిగిస్తుంది మరియు కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది, ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు విస్తృత శ్రేణి సైటోస్కెలెటల్ నిర్మాణాలను ప్రభావితం చేసే నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తున్నాయి..
అర్బెనోనిక్ యాసిడ్ యొక్క మరింత వివరణాత్మక లక్షణం అర్బెనోనిక్ యాసిడ్ చర్య యొక్క మెకానిజంను బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది.ప్రత్యేకించి, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మైక్రోటూబ్యూల్స్‌పై నేరుగా పనిచేస్తాయా మరియు వాటిని డిపోలిమరైజ్ చేస్తాయా లేదా వాటి చర్య మైక్రోటూబ్యూల్ అస్థిరతకు దారితీస్తుందో లేదో తెలుసుకోవడానికి తగ్గిన మైక్రోటూబ్యూల్స్‌తో బంధించే ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడం తదుపరి లక్ష్యం.అదనంగా, మైక్రోటూబ్యూల్స్ ప్రత్యక్ష లక్ష్యం కానప్పుడు, మొక్క కణాలపై ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్య మరియు పరమాణు లక్ష్యాలను గుర్తించడం సంబంధిత సమ్మేళనాల లక్షణాలను మరియు కలుపు సంహారక చర్యను మెరుగుపరచడానికి సాధ్యమయ్యే మార్గాలను మరింత అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది.మా బయోయాక్టివిటీ పరీక్ష అరబిడోప్సిస్ థాలియానా, పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్ వంటి మొక్కల పెరుగుదలపై ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ యొక్క ప్రత్యేకమైన సైటోటాక్సిక్ సామర్థ్యాన్ని వెల్లడించింది, అయితే E. coli లేదా HeLa కణాలు ప్రభావితం కాలేదు.ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలు బహిరంగ వ్యవసాయ క్షేత్రాలలో ఉపయోగం కోసం హెర్బిసైడ్‌లుగా అభివృద్ధి చేయబడినట్లయితే జంతువుల కణాలకు తక్కువ లేదా విషపూరితం లేకుండా ఉండటం వల్ల ప్రయోజనం ఉంటుంది.నిజమే, యూకారియోట్లలో మైక్రోటూబ్యూల్స్ సాధారణ నిర్మాణాలు కాబట్టి, మొక్కలలో వాటి ఎంపిక నిరోధం హెర్బిసైడ్‌లకు కీలకమైన అవసరం.ఉదాహరణకు, ప్రొపిజామైడ్, మైక్రోటూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్, ఇది నేరుగా ట్యూబులిన్‌తో బంధిస్తుంది మరియు పాలిమరైజేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది, జంతు కణాలకు తక్కువ విషపూరితం కారణంగా హెర్బిసైడ్‌గా ఉపయోగించబడుతుంది24.డిసోపైరమైడ్‌కు విరుద్ధంగా, సంబంధిత బెంజమైడ్‌లు విభిన్న లక్ష్య ప్రత్యేకతలను కలిగి ఉంటాయి.మొక్కల మైక్రోటూబ్యూల్స్‌తో పాటు, RH-4032 లేదా బెంజోక్సమైడ్ వరుసగా జంతు కణాల మైక్రోటూబ్యూల్స్ లేదా ఓమైసెట్‌లను కూడా నిరోధిస్తుంది మరియు జాలిలామైడ్ తక్కువ ఫైటోటాక్సిసిటీ కారణంగా శిలీంద్ర సంహారిణిగా ఉపయోగించబడుతుంది25,26,27.కొత్తగా కనుగొన్న ఎలుగుబంటి మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మొక్కలకు వ్యతిరేకంగా సెలెక్టివ్ సైటోటాక్సిసిటీని ప్రదర్శిస్తాయి, అయితే తదుపరి మార్పులు వాటి లక్ష్య విశిష్టతను మార్చగలవని గమనించాలి, వ్యాధికారక శిలీంధ్రాలు లేదా ఓమైసెట్‌ల నియంత్రణకు అదనపు ఉత్పన్నాలను అందించగలవు.
అర్బెనోనిక్ యాసిడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క ప్రత్యేక లక్షణాలు హెర్బిసైడ్లుగా మరియు పరిశోధనా సాధనాలుగా వాటి అభివృద్ధికి ఉపయోగపడతాయి.మొక్క కణ ఆకృతిని నియంత్రించడంలో సైటోస్కెలిటన్ యొక్క ప్రాముఖ్యత విస్తృతంగా గుర్తించబడింది.మోర్ఫోజెనిసిస్‌ను సరిగ్గా నియంత్రించడానికి మైక్రోటూబ్యూల్ డైనమిక్‌లను నియంత్రించడం ద్వారా మొక్కలు కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్ సంస్థ యొక్క సంక్లిష్ట విధానాలను అభివృద్ధి చేశాయని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి.మైక్రోటూబ్యూల్ కార్యకలాపాల నియంత్రణకు కారణమైన పెద్ద సంఖ్యలో అణువులు గుర్తించబడ్డాయి మరియు సంబంధిత పరిశోధనలు ఇప్పటికీ కొనసాగుతున్నాయి3,4,28.మొక్కల కణాలలో మైక్రోటూబ్యూల్ డైనమిక్స్ గురించి మన ప్రస్తుత అవగాహన కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్ సంస్థ యొక్క విధానాలను పూర్తిగా వివరించలేదు.ఉదాహరణకు, డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజలిన్ రెండూ మైక్రోటూబ్యూల్స్‌ను డిపోలిమరైజ్ చేయగలవు, అయితే డిసోపైరమైడ్ తీవ్రమైన మూల వక్రీకరణకు కారణమవుతుంది, అయితే ఒరిజాలిన్ సాపేక్షంగా తేలికపాటి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది.అంతేకాకుండా, మైక్రోటూబ్యూల్‌లను స్థిరీకరించే ట్యూబులిన్‌లోని ఉత్పరివర్తనలు, మూలాలలో డెక్స్‌ట్రోరోటేషన్‌కు కూడా కారణమవుతాయి, అయితే మైక్రోటూబ్యూల్ డైనమిక్‌లను కూడా స్థిరీకరించే పాక్లిటాక్సెల్ అలా చేయదు.అందువల్ల, ఉర్సోలిక్ యాసిడ్ యొక్క పరమాణు లక్ష్యాలను అధ్యయనం చేయడం మరియు గుర్తించడం మొక్కల కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ నియంత్రణపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందించాలి.అదేవిధంగా, డిసోపైరమైడ్ వంటి వక్రీకరించిన పెరుగుదలను ప్రోత్సహించడంలో ప్రభావవంతమైన రసాయనాలు మరియు ఓరిజాలిన్ లేదా కుమమోటోరిక్ యాసిడ్ వంటి తక్కువ ప్రభావవంతమైన రసాయనాల భవిష్యత్ పోలికలు వక్రీకరించిన పెరుగుదల ఎలా జరుగుతుందనే దానిపై ఆధారాలను అందిస్తాయి.
మరోవైపు, ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని వివరించడానికి రక్షణ-సంబంధిత సైటోస్కెలెటల్ పునర్వ్యవస్థీకరణలు మరొక అవకాశం.వ్యాధికారక సంక్రమణం లేదా మొక్కల కణాలలోకి ఎలిసిటర్‌ను ప్రవేశపెట్టడం కొన్నిసార్లు సైటోస్కెలిటన్‌ను నాశనం చేస్తుంది మరియు తదుపరి కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది.ఉదాహరణకు, ఓమైసెట్-ఉత్పన్నమైన క్రిప్టోక్సాంతిన్ పొగాకు కణాల మరణానికి ముందు మైక్రోటూబ్యూల్స్ మరియు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లకు అంతరాయం కలిగిస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది KAND చికిత్సతో సంభవించే విధంగానే30,31.ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన రక్షణ ప్రతిస్పందనలు మరియు సెల్యులార్ ప్రతిస్పందనల మధ్య సారూప్యతలు సాధారణ సెల్యులార్ ప్రక్రియలను ప్రేరేపిస్తాయని మేము ఊహిస్తున్నాము, అయినప్పటికీ క్రిప్టోక్సంతిన్ కంటే ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క వేగవంతమైన మరియు బలమైన ప్రభావం స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది.అయినప్పటికీ, ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ యొక్క అంతరాయం ఆకస్మిక కణ మరణాన్ని ప్రోత్సహిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది ఎల్లప్పుడూ మైక్రోటూబ్యూల్ అంతరాయంతో కలిసి ఉండదు.అదనంగా, ఉర్సోనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలు చేసినట్లుగా, వ్యాధికారక లేదా ఎలిసిటర్ వక్రీకరించిన మూల పెరుగుదలకు కారణమవుతుందా అనేది చూడవలసి ఉంది.అందువల్ల, రక్షణ ప్రతిస్పందనలను మరియు సైటోస్కెలిటన్‌ను అనుసంధానించే పరమాణు జ్ఞానం పరిష్కరించాల్సిన ఆకర్షణీయమైన సమస్య.ఉర్సోనిక్ యాసిడ్‌కు సంబంధించిన తక్కువ మాలిక్యులర్ బరువు సమ్మేళనాల ఉనికిని ఉపయోగించడం ద్వారా, అలాగే వివిధ రకాలైన ఉత్పన్నాల శ్రేణిని ఉపయోగించడం ద్వారా, అవి తెలియని సెల్యులార్ మెకానిజమ్‌లను లక్ష్యంగా చేసుకోవడానికి అవకాశాలను అందించవచ్చు.
కలిసి తీసుకుంటే, మైక్రోటూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను మాడ్యులేట్ చేసే కొత్త సమ్మేళనాల ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం మొక్కల కణ ఆకార నిర్ణయానికి అంతర్లీనంగా ఉన్న సంక్లిష్ట పరమాణు విధానాలను పరిష్కరించడానికి శక్తివంతమైన పద్ధతులను అందిస్తుంది.ఈ సందర్భంలో, మైక్రోటూబ్యూల్స్ మరియు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను ప్రభావితం చేసే మరియు సెల్ డెత్‌ను ప్రేరేపించే ఇటీవల అభివృద్ధి చేసిన సమ్మేళనం ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్, మైక్రోటూబ్యూల్ నియంత్రణ మరియు ఈ ఇతర యంత్రాంగాల మధ్య సంబంధాన్ని అర్థంచేసుకోవడానికి అవకాశాన్ని అందిస్తుంది.ఈ విధంగా, అర్బెనోనిక్ యాసిడ్ ఉపయోగించి రసాయన మరియు జీవ విశ్లేషణ మొక్క సైటోస్కెలిటన్‌ను నియంత్రించే పరమాణు నియంత్రణ విధానాలను అర్థం చేసుకోవడంలో మాకు సహాయపడుతుంది.
2% (w/v) గెలాక్టోస్, 2% (w/v) ఎసెన్స్ పేస్ట్, 1% (w/v) బాక్టో కంపోజిషన్‌తో కూడిన 110 mL విత్తన మాధ్యమాన్ని కలిగి ఉన్న 500 mL అడ్డుపడే ఎర్లెన్‌మేయర్ ఫ్లాస్క్‌లో S. వెర్రెన్సిస్ MK493-CF1ని టీకాలు వేయండి .-సోయ్టన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, ఇంక్.), 0.5% (w/v) మొక్కజొన్న సారం (KOGOSTCH Co., Ltd., జపాన్), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 మరియు 0.2% CaCO3 డీయోనైజ్డ్ నీటిలో.(స్టెరిలైజేషన్ ముందు pH 7.4).విత్తన సంస్కృతులు రోటరీ షేకర్ (180 ఆర్‌పిఎమ్)పై 27 ° C వద్ద 2 రోజుల పాటు పొదిగేవి.ఘన స్థితి కిణ్వ ప్రక్రియ ద్వారా ఉత్పత్తి సాగు.సీడ్ కల్చర్ (7 మి.లీ) 500 ml K-1 ఫ్లాస్క్‌లోకి బదిలీ చేయబడింది, ఇందులో 40 గ్రా ఉత్పత్తి మాధ్యమం 15 గ్రా ఒత్తిడి బార్లీ (MUSO Co. Ltd., జపాన్) మరియు 25 గ్రా డీయోనైజ్డ్ వాటర్ (pH సర్దుబాటు చేయబడలేదు. స్టెరిలైజేషన్ ముందు).)14 రోజులు చీకటిలో 30 ° C వద్ద కిణ్వ ప్రక్రియ జరిగింది.కిణ్వ ప్రక్రియ పదార్థం 40 ml/బాటిల్ EtOHతో సంగ్రహించబడింది మరియు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది (1500 గ్రా, 4 ° C, 10 నిమి).కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ (60 ml) 10% MeOH/EtOAc మిశ్రమంతో సంగ్రహించబడింది.అవశేషాలను (59.5 mg) పొందేందుకు సేంద్రీయ పొర తగ్గిన ఒత్తిడిలో ఆవిరైపోయింది, ఇది HPLCకి గ్రేడియంట్ ఎల్యూషన్ (0–10 నిమిషాలు: 90%)తో రివర్స్ ఫేజ్ కాలమ్ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × పొడవు 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 నిమిషాలు: 90% H2O/CH3CN నుండి 70% H2O/CH3CN (గ్రేడియంట్), 35–45 నిమిషాలు: 90% H2O/EtOH, 45–155 నిమిషాలు: 90% H2O /EtOH నుండి 100% EtOH (గ్రేడియంట్ (గ్రేడియంట్), 155-200 నిమి: 100% EtOH) 1.5 ml/min ప్రవాహం రేటుతో, కౌమామోనామైడ్ (1, 36.0 mg) తెల్లని నిరాకార పొడి వలె వేరుచేయబడింది.
కుమామోటోఅమైడ్(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ లెక్కించిన విలువ: 141.0659, కొలిచిన విలువ: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 15973, 15973 సెం.మీ.
కొలంబియా విత్తనాలు (Col-0) పరిశోధన ఉపయోగం కోసం అనుమతితో అరబిడోప్సిస్ బయోలాజికల్ రిసోర్స్ సెంటర్ (ABRC) నుండి పొందబడ్డాయి.Col-0 విత్తనాలు మా ప్రయోగశాల పరిస్థితులలో ప్రచారం చేయబడ్డాయి మరియు నిర్వహించబడతాయి మరియు అడవి-రకం అరబిడోప్సిస్ మొక్కలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి.అరబిడోప్సిస్ విత్తనాలు 2% సుక్రోజ్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), 0.05% (w/v) 2-(4-మోర్ఫోలినో) ఇథనేసల్ఫోనిక్ యాసిడ్ (MES) (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) కలిగిన సగం-బలం మురాషిగే మరియు స్కూగ్ మాధ్యమంలో ఉపరితల క్రిమిరహితం చేయబడ్డాయి మరియు కల్చర్ చేయబడ్డాయి. )) మరియు 1.5% అగర్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), pH 5.7, 23 °C వద్ద మరియు స్థిరమైన కాంతి.phs1-1 ఉత్పరివర్తన విత్తనాలను T. హషిమోటో (నారా ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు.
స్ట్రెయిన్ SR-1 విత్తనాలను T. హషిమోటో (నారా ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు మరియు అడవి-రకం పొగాకు మొక్కలుగా ఉపయోగించారు.పొగాకు విత్తనాలను ఉపరితల క్రిమిరహితం చేసి, అంకురోత్పత్తిని ప్రోత్సహించడానికి శుభ్రమైన నీటిలో మూడు రాత్రులు నానబెట్టి, ఆపై 2% సుక్రోజ్, 0.05% (w/v) MES, మరియు 0.8% గెల్లాన్ గమ్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) కలిగిన సగం-బలం కలిగిన ద్రావణంలో ఉంచారు. మురాషిగే.మరియు స్కూగ్ మాధ్యమం) pH 5.7తో మరియు స్థిరమైన కాంతిలో 23°C వద్ద పొదిగేది.
స్ట్రెయిన్ టాక్-1 T. కోచి (క్యోటో విశ్వవిద్యాలయం)చే అందించబడింది మరియు లివర్‌వోర్ట్ అధ్యయనం కోసం ప్రామాణిక ప్రయోగాత్మక యూనిట్‌గా ఉపయోగించబడింది.జెమ్మాను క్రిమిరహితం చేసిన కల్చర్డ్ మొక్కల నుండి పొందారు మరియు 1% సుక్రోజ్ మరియు 0.3% గెల్లాన్ గమ్‌ను కలిగి ఉన్న గాంబోర్గ్ B5 మాధ్యమం (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) పై పూత పూయబడింది మరియు నిరంతర కాంతిలో 23 ° C వద్ద పొదిగేది.
పొగాకు BY-2 కణాలు (నికోటియానా టాబాకమ్ L. cv. బ్రైట్ ఎల్లో 2) S. హసెజావా (టోక్యో విశ్వవిద్యాలయం) ద్వారా అందించబడ్డాయి.BY-2 కణాలు సవరించిన లిన్‌స్మీయర్ మరియు స్కూగ్ మాధ్యమంలో 95 రెట్లు కరిగించబడ్డాయి మరియు 2,4-డైక్లోరోఫెనాక్సియాసిటిక్ యాసిడ్ 32తో వారానికొకసారి భర్తీ చేయబడ్డాయి.సెల్ సస్పెన్షన్ చీకటిలో 27 ° C వద్ద 130 rpm వద్ద రోటరీ షేకర్‌పై కలపబడింది.తాజా మాధ్యమం కంటే 10 రెట్లు వాల్యూమ్‌తో సెల్‌లను కడగాలి మరియు అదే మాధ్యమంలో మళ్లీ అమర్చండి.మైక్రోటూబ్యూల్ మార్కర్ TagRFP-TUA6 లేదా కాలీఫ్లవర్ మొజాయిక్ వైరస్ 35S ప్రమోటర్ క్రింద ఉన్న యాక్టిన్ ఫిలమెంట్ మార్కర్ GFP-ABD2ని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే BY-2 ట్రాన్స్‌జెనిక్ సెల్ లైన్లు వివరించిన విధంగా రూపొందించబడ్డాయి.ఈ సెల్ లైన్‌లను అసలు BY-2 సెల్ లైన్ కోసం ఉపయోగించే విధానాలను ఉపయోగించి నిర్వహించవచ్చు మరియు సమకాలీకరించవచ్చు.
హెలా కణాలు దుల్బెకో యొక్క సవరించిన ఈగిల్స్ మీడియం (DMEM) (లైఫ్ టెక్నాలజీస్)లో కల్చర్ చేయబడ్డాయి, ఇవి 10% పిండం బోవిన్ సీరం, 1.2 U/ml పెన్సిలిన్ మరియు 1.2 μg/ml స్ట్రెప్టోమైసిన్‌తో 37°C ఇంక్యుబేటర్‌లో 37°C.
ఈ మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లో వివరించిన అన్ని ప్రయోగాలు జపనీస్ బయో సేఫ్టీ నిబంధనలు మరియు మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా జరిగాయి.
సమ్మేళనాలు డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO; ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్)లో స్టాక్ సొల్యూషన్‌లుగా కరిగించబడ్డాయి మరియు అరబిడోప్సిస్ మరియు పొగాకు లేదా లివర్‌వోర్ట్ కోసం గాంబోర్గ్ B5 మాధ్యమం కోసం MS మాధ్యమంలో కరిగించబడ్డాయి.రూట్ గ్రోత్ ఇన్హిబిషన్ అస్సే కోసం, సూచించిన సమ్మేళనాలు లేదా DMSO ఉన్న అగర్ మాధ్యమంలో ఒక ప్లేట్‌కు 10 కంటే ఎక్కువ విత్తనాలు విత్తారు.విత్తనాలు 7 రోజులు గ్రోత్ చాంబర్‌లో పొదిగేవి.మొలకల ఫోటో తీయబడింది మరియు మూలాల పొడవును కొలుస్తారు.అరబిడోప్సిస్ అంకురోత్పత్తి పరీక్ష కోసం, 200 μM సమ్మేళనం లేదా DMSO కలిగిన అగర్ మాధ్యమంలో ఒక ప్లేట్‌కు 48 విత్తనాలను నాటారు.అరబిడోప్సిస్ విత్తనాలను గ్రోత్ చాంబర్‌లో పెంచారు మరియు అంకురోత్పత్తి (డాగ్) తర్వాత 7 రోజుల తర్వాత మొలకెత్తిన మొలకల సంఖ్యను లెక్కించారు.పొగాకు అంకురోత్పత్తి పరీక్ష కోసం, 200 μM KAND లేదా DMSO కలిగిన అగర్ మాధ్యమంలో ఒక ప్లేట్‌కు 24 విత్తనాలను నాటారు.పొగాకు విత్తనాలను గ్రోత్ చాంబర్‌లో పెంచారు మరియు 14 రోజుల తర్వాత మొలకెత్తిన మొలకల సంఖ్యను లెక్కించారు.లివర్‌వోర్ట్ గ్రోత్ ఇన్హిబిషన్ అస్సే కోసం, ప్రతి ప్లేట్ నుండి 9 పిండాలు అగర్ మాధ్యమంలో KAND లేదా DMSO యొక్క సూచించిన సాంద్రతలను కలిగి ఉంటాయి మరియు 14 రోజుల పాటు గ్రోత్ చాంబర్‌లో పొదిగేవి.
రూట్ మెరిస్టెమ్ ఆర్గనైజేషన్‌ను దృశ్యమానం చేయడానికి 5 mg/ml ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI)తో తడిసిన మొలకలను ఉపయోగించండి.TCS SPE కన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా PI సిగ్నల్స్ గమనించబడ్డాయి.
మలామి మరియు బెన్ఫీ 36 వివరించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం β- గ్లూకురోనిడేస్ (GUS) తో మూలాల యొక్క హిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ జరిగింది.మొలకలు రాత్రిపూట 90% అసిటోన్‌లో స్థిరపరచబడ్డాయి, GUS బఫర్‌లో 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic యాసిడ్‌తో 1 గంట పాటు తడిసిన మరియు హైడ్రేటెడ్ క్లోరాల్డిహైడ్ ద్రావణంలో ఉంచబడ్డాయి.(8 గ్రా క్లోరల్ హైడ్రేట్, 2 ml నీరు మరియు 1 ml గ్లిసరాల్) మరియు యాక్సియో ఇమేజర్ M1 మైక్రోస్కోప్ (కార్ల్ జీస్) ఉపయోగించి అవకలన జోక్యం కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా గమనించబడింది.
నిలువుగా ఉంచిన ప్లేట్లలో పెరిగిన 7-రోజుల వయస్సు గల మొలకలపై మూల కోణాలను కొలుస్తారు.దశ 6లో వివరించిన విధంగా గురుత్వాకర్షణ వెక్టార్ దిశ నుండి రూట్ యొక్క కోణాన్ని కొలవండి.
ప్రోటోకాల్ 37కి చిన్న మార్పులతో, వివరించిన విధంగా కార్టికల్ మైక్రోటూబ్యూల్స్ యొక్క అమరిక గమనించబడింది.యాంటీ- ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీ (KMX-1, మెర్క్ మిల్లిపోర్: MAB3408) మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్ 488-కంజుగేటెడ్ యాంటీ-మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A32723) 1:1000 మరియు 1:100 పలుచన వద్ద ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ ప్రతిరోధకాలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి. వరుసగా.TCS SPE కన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలు పొందబడ్డాయి.Z-స్టాక్ చిత్రాలను పొందండి మరియు తయారీదారు సూచనల ప్రకారం గరిష్ట తీవ్రత అంచనాలను సృష్టించండి.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి HeLa సెల్ ప్రొలిఫరేషన్ అస్సే నిర్వహించబడింది.
E. coli DH5α యొక్క పెరుగుదలను 600 nm (OD600) వద్ద స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ఉపయోగించి సంస్కృతిలో సెల్ సాంద్రతను కొలవడం ద్వారా విశ్లేషించబడింది.
CSU-X1 కన్ఫోకల్ స్కానింగ్ పరికరం (యోకోగావా) మరియు sCMOS కెమెరా (జైలా, ఆండోర్ టెక్నాలజీ)తో కూడిన ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్‌ని ఉపయోగించి ట్రాన్స్‌జెనిక్ BY-2 కణాలలో సైటోస్కెలెటల్ సంస్థ గమనించబడింది.చిత్ర విశ్లేషణ ద్వారా సైటోస్కెలెటల్ సాంద్రత అంచనా వేయబడింది, ఇది వివరించిన విధంగా ImageJ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి కన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లలో సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలెటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించింది.
BY-2 కణాలలో సెల్ మరణాన్ని గుర్తించడానికి, సెల్ సస్పెన్షన్ యొక్క ఆల్కాట్ గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 10 నిమిషాల పాటు 0.05% ఎవాన్స్ బ్లూతో పొదిగేది.మృతకణాల సెలెక్టివ్ ఎవాన్స్ బ్లూ స్టెయినింగ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న ప్లాస్మా పొర ద్వారా ఆచరణీయ కణాల నుండి రంగును బయటకు తీయడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.బ్రైట్-ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోప్ (BX53, ఒలింపస్) ఉపయోగించి తడిసిన కణాలు గమనించబడ్డాయి.
37°C మరియు 5% CO2 వద్ద తేమతో కూడిన ఇంక్యుబేటర్‌లో 10% FBSతో అనుబంధంగా DMEMలో హెలా కణాలు పెరిగాయి.కణాలు 100 μM KAND 11, కుమమోనామిక్ యాసిడ్ 6, కుమమోనామైడ్ 1, 100 ng/ml కోల్సెమిడ్ (గిబ్కో), లేదా 100 ng/ml నోకోడ్‌మేజ్ (సిగ్మా)తో 6 h 37 ° C వద్ద చికిత్స చేయబడ్డాయి.కణాలు MetOHతో 10 నిమిషాలు మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాలు అసిటేట్‌తో పరిష్కరించబడ్డాయి.స్థిర కణాలు β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ (1D4A4, ప్రొటీన్‌టెక్: 66240-1)తో 0.5% BSA/PBSలో 2 గంటల పాటు పలుచన చేసి, TBSTతో 3 సార్లు కడిగి, ఆపై అలెక్సా ఫ్లోర్ మేక యాంటీబాడీతో పొదిగేవి.488 1 గంట.– మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A11001) మరియు 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBSలో పలుచన చేయబడింది.TBSTతో మూడు సార్లు కడిగిన తర్వాత, నికాన్ ఎక్లిప్స్ Ti-E ఇన్వర్టెడ్ మైక్రోస్కోప్‌లో తడిసిన కణాలు గమనించబడ్డాయి.MetaMorph సాఫ్ట్‌వేర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ఉపయోగించి చల్లబడిన హమామట్సు ORCA-R2 CCD కెమెరాతో చిత్రాలు తీయబడ్డాయి.