మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే నవల మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాలుగా ఉర్సా మోనోమైడ్‌ల ఆవిష్కరణ, లక్షణం మరియు క్రియాత్మక మెరుగుదల.

Nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ పరిమిత CSS మద్దతును కలిగి ఉంది. ఉత్తమ ఫలితాల కోసం, మీరు మీ బ్రౌజర్ యొక్క కొత్త వెర్షన్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను నిలిపివేయండి). ఈలోగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైలింగ్ లేదా జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ను చూపిస్తున్నాము.
సహజ ఉత్పత్తుల ఆవిష్కరణ మరియు ప్రయోజనకరమైన ఉపయోగం మానవ జీవితాన్ని మెరుగుపరచడంలో సహాయపడుతుంది. కలుపు మొక్కలను నియంత్రించడానికి మొక్కల పెరుగుదల నిరోధక రసాయనాలను కలుపు సంహారకాలుగా విస్తృతంగా ఉపయోగిస్తారు. వివిధ రకాల కలుపు సంహారకాలను ఉపయోగించాల్సిన అవసరం ఉన్నందున, కొత్త చర్యల విధానాలతో కూడిన సమ్మేళనాలను గుర్తించాల్సిన అవసరం ఉంది. ఈ అధ్యయనంలో, మేము స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రెన్సిస్ MK493-CF1 నుండి ఒక నవల N-ఆల్కాక్సిపైరోల్ సమ్మేళనం, కూమమోనమైడ్‌ను కనుగొన్నాము మరియు పూర్తి సంశ్లేషణ ప్రక్రియను స్థాపించాము. జీవసంబంధ కార్యకలాపాల పరీక్షల ద్వారా, ఉర్స్-మోనోఅమిక్ ఆమ్లం ఉర్స్-మోనోఅమైడ్ యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్ మరియు సంభావ్యత అని మేము కనుగొన్నాము.మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం. అదనంగా, మేము వివిధ అర్బెనోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను అభివృద్ధి చేసాము, వాటిలో అర్బెనిలాక్సీ ఉత్పన్నం (UDA) కూడా ఉంది, ఇది HeLa కణాల పెరుగుదలను ప్రతికూలంగా ప్రభావితం చేయకుండా అధిక కలుపు సంహారక చర్యను కలిగి ఉంటుంది. ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌కు అంతరాయం కలిగిస్తాయని కూడా మేము కనుగొన్నాము; అదనంగా, KAND ఆక్టిన్ తంతువులను ప్రభావితం చేస్తుంది మరియు కణాల మరణాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది; ఈ బహుముఖ ప్రభావాలు తెలిసిన మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిరోధకాల నుండి భిన్నంగా ఉంటాయి మరియు ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం కోసం చర్య యొక్క కొత్త యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తాయి, ఇది కొత్త కలుపు సంహారకాల అభివృద్ధిలో ముఖ్యమైన ప్రయోజనాన్ని సూచిస్తుంది.
ప్రయోజనకరమైన సహజ ఉత్పత్తులు మరియు వాటి ఉత్పన్నాల ఆవిష్కరణ మరియు ఆచరణాత్మక అనువర్తనం మానవ జీవన నాణ్యతను మెరుగుపరచడానికి ఒక మార్గం. సూక్ష్మజీవులు, మొక్కలు మరియు కీటకాలు ఉత్పత్తి చేసే ద్వితీయ జీవక్రియలు వైద్యం మరియు వ్యవసాయంలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీశాయి. అనేక యాంటీబయాటిక్స్ మరియు యాంటీ-లుకేమియా మందులు సహజ ఉత్పత్తుల నుండి అభివృద్ధి చేయబడ్డాయి. అదనంగా, వివిధ రకాలపురుగుమందులు, వ్యవసాయంలో ఉపయోగం కోసం ఈ సహజ ఉత్పత్తుల నుండి శిలీంద్రనాశకాలు మరియు కలుపు సంహారకాలు సంగ్రహించబడతాయి. ముఖ్యంగా, ఆధునిక వ్యవసాయంలో పంట దిగుబడిని పెంచడానికి కలుపు నియంత్రణ కలుపు సంహారకాలు ముఖ్యమైన సాధనాలు మరియు వివిధ రకాల సమ్మేళనాలు ఇప్పటికే వాణిజ్యపరంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి. కిరణజన్య సంయోగక్రియ, అమైనో ఆమ్ల జీవక్రియ, సెల్ గోడ సంశ్లేషణ, మైటోసిస్ నియంత్రణ, ఫైటోహార్మోన్ సిగ్నలింగ్ లేదా ప్రోటీన్ సంశ్లేషణ వంటి మొక్కలలోని అనేక సెల్యులార్ ప్రక్రియలు కలుపు సంహారకాల యొక్క సాధారణ లక్ష్యాలుగా పరిగణించబడతాయి. మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించే సమ్మేళనాలు మైటోటిక్ నియంత్రణను ప్రభావితం చేయడం ద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను ప్రభావితం చేసే కలుపు సంహారకాల యొక్క సాధారణ తరగతి.
మైక్రోట్యూబుల్స్ అనేవి సైటోస్కెలిటన్ యొక్క భాగాలు మరియు యూకారియోటిక్ కణాలలో విస్తృతంగా సంరక్షించబడతాయి. ట్యూబులిన్ హెటెరోడైమర్ α-ట్యూబులిన్ మరియు β-ట్యూబులిన్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఇవి లీనియర్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ ప్రోటోఫిలమెంట్‌లను ఏర్పరుస్తాయి, 13 ప్రోటోఫిలమెంట్‌లు స్థూపాకార నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తాయి. కణ ఆకారాన్ని నిర్ణయించడం, కణ విభజన మరియు కణాంతర రవాణాతో సహా మొక్క కణాలలో మైక్రోట్యూబుల్స్ బహుళ పాత్రలను పోషిస్తాయి3,4. మొక్క కణాలు ఇంటర్‌ఫేస్ ప్లాస్మా పొర క్రింద మైక్రోట్యూబుల్‌లను కలిగి ఉంటాయి మరియు ఈ కార్టికల్ మైక్రోట్యూబుల్స్ అని పిలవబడేవి సెల్యులోజ్ సింథేస్ కాంప్లెక్స్‌ల నియంత్రణ ద్వారా సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబ్రిల్స్ యొక్క సంస్థను నియంత్రిస్తాయని భావిస్తున్నారు4,5. రూట్ టిప్ యొక్క వేగవంతమైన పొడిగింపు జోన్‌లో ఉన్న రూట్ ఎపిడెర్మల్ కణాల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబుల్స్ పార్శ్వంగా ఉంటాయి మరియు సెల్యులోజ్ మైక్రోఫైబర్‌లు ఈ మైక్రోట్యూబ్యూల్‌లను అనుసరిస్తాయి మరియు కణ విస్తరణ దిశను పరిమితం చేస్తాయి, తద్వారా అనిసోట్రోపిక్ సెల్ పొడుగును ప్రోత్సహిస్తాయి. అందువల్ల, మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఫంక్షన్ మొక్కల స్వరూప శాస్త్రానికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంటుంది. ట్యూబులిన్‌ను ఎన్కోడింగ్ చేసే జన్యువులలోని అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలు అరబిడోప్సిస్ 6,7 లో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ శ్రేణుల వక్రీకరణకు మరియు ఎడమ లేదా కుడి వైపు పెరుగుదలకు కారణమవుతాయి. అదేవిధంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను నియంత్రించే మైక్రోట్యూబ్యూల్-అనుబంధ ప్రోటీన్‌లలోని ఉత్పరివర్తనలు కూడా వక్రీకరించబడిన మూల పెరుగుదలకు దారితీయవచ్చు8,9,10,11,12,13. అదనంగా, ప్రీటిలాక్లోర్ అని కూడా పిలువబడే డిస్పోపైరమైడ్ వంటి మైక్రోట్యూబ్యూల్-అంతరాయం కలిగించే కలుపు మందులతో చికిత్స కూడా ఎడమ వైపు వాలుగా ఉండే మూల పెరుగుదలకు కారణమవుతుంది14. మొక్కల పెరుగుదల దిశను నిర్ణయించడానికి మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఫంక్షన్ యొక్క ఖచ్చితమైన నియంత్రణ చాలా కీలకమని ఈ డేటా సూచిస్తుంది.
వివిధ రకాల మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు కనుగొనబడ్డాయి మరియు ఈ మందులు సైటోస్కెలిటల్ పరిశోధనకు, అలాగే వ్యవసాయం మరియు వైద్యానికి గణనీయమైన కృషి చేశాయి2. ముఖ్యంగా, ఒరిజాలిన్, డైనిట్రోఅనిలిన్ సమ్మేళనాలు, డైసోపైరమైడ్, బెంజామైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాలు మరియు వాటి అనలాగ్‌లు మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరును నిరోధించగలవు మరియు తద్వారా మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయి. అందువల్ల, వాటిని విస్తృతంగా కలుపు సంహారకాలుగా ఉపయోగిస్తారు. అయితే, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మొక్క మరియు జంతు కణాలలో ముఖ్యమైన భాగం కాబట్టి, చాలా మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు రెండు కణ రకాలకు సైటోటాక్సిక్‌గా ఉంటాయి. అందువల్ల, కలుపు సంహారకాలుగా వాటి గుర్తింపు ప్రయోజనం ఉన్నప్పటికీ, పరిమిత సంఖ్యలో యాంటీమైక్రోట్యూబ్యూల్ ఏజెంట్‌లను ఆచరణాత్మక ప్రయోజనాల కోసం ఉపయోగిస్తారు.
స్ట్రెప్టోమైసెస్ అనేది స్ట్రెప్టోమైసెస్ కుటుంబానికి చెందిన ఒక జాతి, ఇందులో ఏరోబిక్, గ్రామ్-పాజిటివ్, ఫిలమెంటస్ బ్యాక్టీరియా ఉన్నాయి మరియు విస్తృత శ్రేణి ద్వితీయ జీవక్రియలను ఉత్పత్తి చేసే సామర్థ్యం ఉంది. అందువల్ల, ఇది కొత్త జీవశాస్త్రపరంగా చురుకైన సహజ ఉత్పత్తుల యొక్క అతి ముఖ్యమైన వనరులలో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది. ప్రస్తుత అధ్యయనంలో, మేము కూమమోనామైడ్ అనే కొత్త సమ్మేళనాన్ని కనుగొన్నాము, ఇది స్ట్రెప్టోమైసెస్ వెర్రెన్సిస్ MK493-CF1 మరియు S. వెర్రెన్సిస్ ISP 5486 నుండి వేరుచేయబడింది. స్పెక్ట్రల్ విశ్లేషణ మరియు పూర్తి స్పెక్ట్రల్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి, కూమమోనామైడ్ యొక్క నిర్మాణం వర్గీకరించబడింది మరియు దాని ప్రత్యేకమైన N-ఆల్కాక్సిపైరోల్ అస్థిపంజరం నిర్ణయించబడింది. సంశ్లేషణ. ఉర్స్మోనోమైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్ అయిన ఉర్స్మోనిక్ ఆమ్లం, ప్రసిద్ధ మోడల్ మొక్క అరబిడోప్సిస్ థాలియానా యొక్క పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిని నిరోధించగలదని కనుగొనబడింది. నిర్మాణ-కార్యాచరణ సంబంధ అధ్యయనంలో, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లంగా మార్చబడిన C9 కలిగిన సమ్మేళనం, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం (KAND) యొక్క నానిలోక్సీ ఉత్పన్నం, పెరుగుదల మరియు అంకురోత్పత్తిపై నిరోధక ప్రభావాన్ని గణనీయంగా పెంచుతుందని మేము కనుగొన్నాము. ముఖ్యంగా, కొత్తగా కనుగొన్న మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్ పెరుగుదలను కూడా ప్రభావితం చేసింది మరియు బ్యాక్టీరియా లేదా HeLa కణాలకు సైటోటాక్సిక్ కాదు. అంతేకాకుండా, కొన్ని ఉర్మోటోనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలు వక్రీకరించబడిన రూట్ ఫినోటైప్‌ను ప్రేరేపిస్తాయి, ఈ ఉత్పన్నాలు ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయని సూచిస్తున్నాయి. ఈ ఆలోచనకు అనుగుణంగా, ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్‌గా లేదా ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్‌లతో లేబుల్ చేయబడిన మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై మా పరిశీలనలు KAND చికిత్స మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను డిపాలిమరైజ్ చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. అదనంగా, కుమామోటోనిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నాలతో చికిత్స ఆక్టిన్ మైక్రోఫిలమెంట్‌లను అంతరాయం కలిగించింది. అందువల్ల, సైటోస్కెలిటన్ నాశనంతో కూడిన ప్రత్యేకమైన చర్య విధానంతో కూడిన కొత్త మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకాన్ని మేము కనుగొన్నాము.
టోక్యోలోని షినాగావా-కులోని మట్టి నుండి MK493-CF1 జాతిని వేరు చేశారు. MK493-CF1 జాతి బాగా శాఖలుగా ఉండే స్ట్రోమల్ మైసిలియంను ఏర్పరుస్తుంది. 16S రైబోసోమల్ RNA జన్యువు (1422 bp) యొక్క పాక్షిక క్రమం నిర్ణయించబడింది. ఈ జాతి S. వెర్రెయెన్సిస్ (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: సాధారణ జాతి, 99.93%) కు చాలా పోలి ఉంటుంది. ఈ ఫలితం ఆధారంగా, ఈ జాతి S. వెర్రెయెన్సిస్ రకం జాతికి దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉందని నిర్ధారించబడింది. అందువల్ల, మేము ఈ జాతికి తాత్కాలికంగా S. వెర్రెయెన్సిస్ MK493-CF1 అని పేరు పెట్టాము. S. వెర్రెయెన్సిస్ ISP 5486T కూడా అదే బయోయాక్టివ్ సమ్మేళనాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ఈ సూక్ష్మజీవి నుండి సహజ ఉత్పత్తులను పొందడంపై ప్రారంభ పరిశోధనలు తక్కువగా ఉన్నందున, మరింత రసాయన పరిశోధన జరిగింది. బార్లీ మాధ్యమంలో 30°C వద్ద ఘన-స్థితి కిణ్వ ప్రక్రియ ద్వారా 14 రోజుల పాటు S. werraensis MK493-CF1 ను పండించిన తర్వాత, మాధ్యమాన్ని 50% EtOH తో సేకరించారు. 59.5 mg ముడి సారం పొందడానికి 60 ml నమూనాను ఎండబెట్టారు. ముడి సారం N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide అని పిలుస్తారు, 36.0 mg) ఇవ్వడానికి రివర్స్ ఫేజ్ HPLC కి లోనైంది. 1 యొక్క మొత్తం ముడి సారం యొక్క దాదాపు 60%. అందువల్ల, కుమామోటోఅమైడ్ 1 యొక్క లక్షణాలను వివరంగా అధ్యయనం చేయాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.
కూమమోనమైడ్ 1 అనేది తెల్లని అస్ఫారస పొడి మరియు అధిక రిజల్యూషన్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (HRESIMS) C6H8N2O2 ని నిర్ధారిస్తుంది (చిత్రం 1). ఈ సమ్మేళనం యొక్క C2-ప్రత్యామ్నాయ పైరోల్ భాగం δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR స్పెక్ట్రంలో δH: 4.5 Hz, H-5) మరియు δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ద్వారా వర్గీకరించబడుతుంది మరియు 13C NMR స్పెక్ట్రం నాలుగు sp2 కార్బన్ అణువుల ఉనికిని చూపుతుంది. C2 స్థానంలో అమైడ్ సమూహం యొక్క ఉనికిని δC 161.1 వద్ద C-3 ప్రోటాన్ నుండి అమైడ్ కార్బొనిల్ కార్బన్‌కు HMBC సహసంబంధం ద్వారా అంచనా వేయబడింది. అదనంగా, δH 4.10 (3H, S) మరియు δC 68.3 వద్ద 1 H మరియు 13 C NMR శిఖరాలు అణువులో N-మెథాక్సీ సమూహాల ఉనికిని సూచిస్తాయి. మెరుగైన తేడా స్పెక్ట్రోస్కోపీ మరియు న్యూక్లియర్ ఓవర్‌హౌజర్ సంక్షిప్తీకరణ (NOEDF) వంటి స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి మెథాక్సీ సమూహం యొక్క సరైన స్థానం ఇంకా నిర్ణయించబడనప్పటికీ, N-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సమైడ్ మొదటి అభ్యర్థి సమ్మేళనంగా మారింది.
1 యొక్క సరైన నిర్మాణాన్ని నిర్ణయించడానికి, మొత్తం సంశ్లేషణ నిర్వహించబడింది (Fig. 2a). వాణిజ్యపరంగా లభించే 2-అమినోపైరిడిన్ 2 ను m-CPBA తో చికిత్స చేయడం వలన సంబంధిత N-ఆక్సైడ్ 3 పరిమాణాత్మక దిగుబడికి దారితీసింది. 2 యొక్క 2-అమినోఅజైడేషన్ తర్వాత, అబ్రమోవిచ్ వివరించిన సైక్లోకండెన్సేషన్ ప్రతిచర్యను బెంజీన్‌లో 90°C వద్ద నిర్వహించి, కావలసిన 1-హైడ్రాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బోనిట్రైల్ 5 గ్రాములలో పొందారు. వేగం 60% (రెండు దశలు). 15,16. 4 యొక్క మిథైలేషన్ మరియు జలవిశ్లేషణ తరువాత మంచి దిగుబడిలో (70%, రెండు దశలు) 1-మెథాక్సీ-1H-పైరోల్-2-కార్బాక్సిలిక్ ఆమ్లం ("క్యుమోటోనిక్ ఆమ్లం" అని పిలుస్తారు, 6) ఇచ్చింది. చివరగా, సజల అమ్మోనియాను ఉపయోగించి యాసిడ్ క్లోరైడ్ ఇంటర్మీడియట్ 6 ద్వారా అమిడేషన్ 98% దిగుబడిలో కుమామోటో అమైడ్ 1ని ఇచ్చింది. సంశ్లేషణ చేయబడిన 1 యొక్క అన్ని స్పెక్ట్రల్ డేటా వివిక్త 1ని పోలి ఉంటుంది, కాబట్టి 1 యొక్క నిర్మాణం నిర్ణయించబడింది;
ఉర్బెనమైడ్ మరియు ఉర్బెనిక్ ఆమ్లం యొక్క జీవసంబంధ కార్యకలాపాల సాధారణ సంశ్లేషణ మరియు విశ్లేషణ. (ఎ) కుమామోటో అమైడ్ యొక్క మొత్తం సంశ్లేషణ. (బి) ఏడు రోజుల వయసున్న అడవి-రకం అరబిడోప్సిస్ కొలంబియా (కోల్) మొలకలను మురాషిగే మరియు స్కూగ్ (ఎంఎస్) ప్లేట్లపై కౌమామోనామైడ్ 6 లేదా కౌమామోనామైడ్ 1 కలిగి ఉన్నట్లు సూచించిన సాంద్రతలలో పెంచారు. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ.
మొదట, మొక్కల పెరుగుదలను మాడ్యులేట్ చేసే సామర్థ్యం కోసం ఉర్బెనమైడ్ మరియు దాని మధ్యవర్తుల జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను మేము అంచనా వేసాము. ఈ మాధ్యమంలో MS అగర్ మాధ్యమానికి మరియు కల్చర్డ్ అరబిడోప్సిస్ థాలియానా మొలకలకు మేము ఉర్మోనామైడ్ 1 లేదా ఉర్మోనిక్ ఆమ్లం 6 యొక్క వివిధ సాంద్రతలను జోడించాము. ఈ పరీక్షలు 6 యొక్క అధిక సాంద్రతలు (500 μM) వేర్ల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయని చూపించాయి (Fig. 2b). తరువాత, 6 యొక్క N1 స్థానాన్ని ప్రత్యామ్నాయం చేయడం ద్వారా మేము వివిధ ఉత్పన్నాలను ఉత్పత్తి చేసాము మరియు వాటిపై నిర్మాణ-కార్యాచరణ సంబంధ అధ్యయనాలను నిర్వహించాము (అనలాగ్ సంశ్లేషణ ప్రక్రియ సహాయక సమాచారం (SI)లో వివరించబడింది). అరబిడోప్సిస్ మొలకలని 50 μM ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను కలిగి ఉన్న మాధ్యమంలో పెంచారు మరియు మూల పొడవును కొలుస్తారు. చిత్రంలో చూపిన విధంగా. బొమ్మలు 3a, b మరియు S1లో చూపినట్లుగా, కూమామో ఆమ్లాలు N1 స్థానంలో వేర్వేరు పొడవుల లీనియర్ ఆల్కాక్సీ గొలుసులను (9, 10, 11, 12, మరియు 13) లేదా పెద్ద ఆల్కాక్సీ గొలుసులను (15, 16, మరియు 17) కలిగి ఉంటాయి. ఉత్పన్నాలు వేర్ల పెరుగుదలను గణనీయంగా నిరోధించాయి. అదనంగా, 200 μM 10, 11, లేదా 17 వాడకం అంకురోత్పత్తిని నిరోధించిందని మేము కనుగొన్నాము (Figs. 3c మరియు S2).
కుమామోటో అమైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాల నిర్మాణం-కార్యాచరణ సంబంధం యొక్క అధ్యయనం. (ఎ) అనలాగ్‌ల నిర్మాణం మరియు సంశ్లేషణ పథకం. (బి) 50 μM కౌమామోనామైడ్ ఉత్పన్నాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో పెరిగిన 7 రోజుల వయస్సు గల మొలకల వేర్ల పొడవు యొక్క పరిమాణీకరణ. ఆస్టరిస్క్‌లు నకిలీ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p< 0.05). n>18. డేటాను సగటు ± SD గా చూపించారు. nt అంటే "పరీక్షించబడలేదు" ఎందుకంటే 50% కంటే ఎక్కువ విత్తనాలు మొలకెత్తలేదు. (సి) 200 μM కౌమమోనామైడ్ మరియు సంబంధిత సమ్మేళనాలతో లేదా లేకుండా MS మాధ్యమంలో 7 రోజులు పొదిగిన చికిత్స చేసిన విత్తనాల అంకురోత్పత్తి రేటు యొక్క పరిమాణీకరణ. ఆస్టరిస్క్‌లు నకిలీ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (చి-స్క్వేర్ పరీక్ష). n=96.
ఆసక్తికరంగా, C9 కంటే పొడవైన ఆల్కైల్ సైడ్ చెయిన్‌లను జోడించడం వలన నిరోధక చర్య తగ్గింది, కుమామోటోయిక్ ఆమ్ల సంబంధిత సమ్మేళనాలు వాటి జీవసంబంధ కార్యకలాపాలను ప్రదర్శించడానికి ఒక నిర్దిష్ట పరిమాణంలోని సైడ్ చెయిన్‌లు అవసరమని సూచిస్తున్నాయి.
నిర్మాణ-కార్యాచరణ సంబంధ విశ్లేషణలో C9 ఉర్సోనిక్ ఆమ్లంగా మార్చబడిందని మరియు ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క నానిలాక్సీ ఉత్పన్నం (ఇకపై KAND 11 గా సూచిస్తారు) అత్యంత ప్రభావవంతమైన మొక్కల పెరుగుదల నిరోధకం అని తేలింది కాబట్టి, మేము KAND 11 యొక్క మరింత వివరణాత్మక లక్షణాలను నిర్వహించాము. అరబిడోప్సిస్‌ను 50 μM KAND 11 తో చికిత్స చేయడం వల్ల అంకురోత్పత్తి దాదాపు పూర్తిగా నిరోధించబడింది, అయితే తక్కువ సాంద్రతలు (40, 30, 20, లేదా 10 μM) KAND 11 మోతాదు-ఆధారిత పద్ధతిలో వేర్ల పెరుగుదలను నిరోధించాయి (Fig. 4a, b). KAND 11 రూట్ మెరిస్టెమ్ సాధ్యతను ప్రభావితం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి, మేము ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI) తో తడిసిన రూట్ మెరిస్టెమ్‌లను మరియు కొలిచిన మెరిస్టెమ్ వైశాల్య పరిమాణాన్ని పరిశీలించాము. 25 μM KAND-11 కలిగిన మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 151.1 ± 32.5 μm, అయితే DMSO కలిగిన నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మెరిస్టెమ్ పరిమాణం 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), ఇది KAND-11 సెల్యులార్ కార్యకలాపాలను పునరుద్ధరిస్తుందని సూచిస్తుంది. వ్యాప్తి చెందుతుంది. రూట్ మెరిస్టెమ్. దీనికి అనుగుణంగా, KAND 11 చికిత్స రూట్ మెరిస్టెమ్‌లో సెల్ డివిజన్ మార్కర్ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS సిగ్నల్ మొత్తాన్ని తగ్గించింది (Fig. 4e) 17. ఈ ఫలితాలు KAND 11 కణాల విస్తరణ కార్యకలాపాలను తగ్గించడం ద్వారా మూల పెరుగుదలను నిరోధిస్తుందని సూచిస్తున్నాయి.
ఉర్బెనోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు (ఉర్బెనిలాక్సీ ఉత్పన్నాలు) పెరుగుదలపై నిరోధక ప్రభావం యొక్క విశ్లేషణ. (ఎ) KAND 11 యొక్క సూచించబడిన సాంద్రతలతో MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన 7 రోజుల వయస్సు గల అడవి-రకం కోల్ మొలకల. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ. (బి) వేర్ల పొడవు యొక్క పరిమాణం. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p< 0.05). n>16. డేటాను సగటు ± SD గా చూపించారు. (సి) 25 μM KAND తో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్లపై పెరిగిన ప్రొపిడియం అయోడైడ్-స్టెయిన్డ్ వైల్డ్-టైప్ కోల్ రూట్స్ యొక్క కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ 11. తెల్ల బ్రాకెట్లు రూట్ మెరిస్టెమ్‌ను సూచిస్తాయి. స్కేల్ బార్ = 100 µm. (డి) రూట్ మెరిస్టెమ్ పరిమాణం యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 10 నుండి 11). t-పరీక్ష ఉపయోగించి గణాంక వ్యత్యాసాలను నిర్ణయించారు (p< 0.05). బార్లు సగటు మెరిస్టెమ్ పరిమాణాన్ని సూచిస్తాయి. (e) CDKB2 నిర్మాణాన్ని కలిగి ఉన్న రూట్ మెరిస్టెమ్ యొక్క డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్ఫెరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ (DIC) మైక్రోస్కోపీ; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND అస్సేతో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన 5 రోజుల వయస్సు గల మొలకల మీద 1-GUS మరకలు వేయబడి మరకలు వేయబడ్డాయి.
KAND 11 యొక్క ఫైటోటాక్సిసిటీని మరొక ద్విదళ బీజ మొక్క, పొగాకు (నికోటియానా టాబాకమ్) మరియు ఒక ప్రధాన భూ మొక్క నమూనా జీవి, లివర్‌వోర్ట్ (మార్చాంటియా పాలిమార్ఫా) ఉపయోగించి మరింత పరీక్షించారు. అరబిడోప్సిస్ విషయంలో వలె, 25 μM KAND 11 కలిగిన మాధ్యమంలో పెరిగిన పొగాకు SR-1 మొలకల తక్కువ వేర్లు ఉత్పత్తి చేశాయి (Fig. 5a). అదనంగా, 48 విత్తనాలలో 40 200 μM KAND 11 కలిగిన ప్లేట్‌లపై మొలకెత్తాయి, అయితే అన్ని 48 విత్తనాలు మాక్-ట్రీట్ చేసిన మీడియాలో మొలకెత్తాయి, ఇది KAND యొక్క అధిక సాంద్రతలు గణనీయంగా ఉన్నాయని సూచిస్తుంది (p< 0.05; చి టెస్ట్ -స్క్వేర్) పొగాకు అంకురోత్పత్తిని నిరోధించింది. (Fig. 5b). అదనంగా, లివర్‌వోర్ట్‌లో బ్యాక్టీరియా పెరుగుదలను నిరోధించే KAND 11 యొక్క సాంద్రత అరబిడోప్సిస్‌లోని ప్రభావవంతమైన సాంద్రతకు సమానంగా ఉంది (Fig. 5c). ఈ ఫలితాలు KAND 11 వివిధ రకాల మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధించగలదని సూచిస్తున్నాయి. తరువాత మేము ఇతర జీవులలో, అంటే మానవ HeLa కణాలు మరియు Escherichia coli జాతి DH5α లలో ఎలుగుబంటి మోనోఅమైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని వరుసగా అధిక జంతు మరియు బ్యాక్టీరియా కణాల ప్రతినిధులుగా పరిశోధించాము. కణాల విస్తరణ పరీక్షల శ్రేణిలో, 100 μM (Fig. 5d,e) సాంద్రతలలో coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 మరియు KAND 11 HeLa లేదా E. coli కణాల పెరుగుదలను ప్రభావితం చేయలేదని మేము గమనించాము.
అరబిడోప్సిస్ కాని జీవులలో KAND 11 పెరుగుదల నిరోధం. (ఎ) రెండు వారాల వయస్సు గల అడవి-రకం SR-1 పొగాకు మొలకలను 25 μM KAND 11 కలిగిన నిలువుగా ఉంచబడిన MS ప్లేట్‌లపై పెంచారు. (బి) రెండు వారాల వయస్సు గల అడవి-రకం SR-1 పొగాకు మొలకలను 200 μM KAND 11 కలిగిన అడ్డంగా ఉంచబడిన MS ప్లేట్‌లపై పెంచారు. (సి) KAND 11 యొక్క సూచించబడిన సాంద్రతలతో గాంబోర్గ్ B5 ప్లేట్‌లపై పెరిగిన రెండు వారాల వయస్సు గల అడవి-రకం Tak-1 లివర్‌వోర్ట్ మొగ్గలు. రెండు వారాల పొదిగే కాలంలో పెరుగుదల ఆగిపోయిన బీజాంశాలను ఎరుపు బాణాలు సూచిస్తాయి. (డి) HeLa కణాల కణ విస్తరణ పరీక్ష. సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి స్థిర సమయ వ్యవధిలో ఆచరణీయ కణాల సంఖ్యను కొలుస్తారు. నియంత్రణగా, HeLa కణాలను 5 μg/ml ఆక్టినోమైసిన్ D (యాక్ట్ D) తో చికిత్స చేశారు, ఇది RNA పాలిమరేస్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు కణ మరణానికి కారణమవుతుంది. విశ్లేషణలు త్రిపాదిలో నిర్వహించబడ్డాయి. (ఇ) E. కోలి సెల్ విస్తరణ పరీక్ష. E. coli పెరుగుదలను OD600 కొలవడం ద్వారా విశ్లేషించారు. నియంత్రణగా, కణాలకు 50 μg/ml యాంపిసిలిన్ (Amp) తో చికిత్స చేశారు, ఇది బాక్టీరియల్ సెల్ గోడ సంశ్లేషణను నిరోధిస్తుంది. విశ్లేషణలు మూడుసార్లు జరిగాయి.
యురామైడ్-సంబంధిత సమ్మేళనాల వల్ల కలిగే సైటోటాక్సిసిటీ చర్య యొక్క యంత్రాంగాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము మితమైన నిరోధక ప్రభావాలతో ఉర్బెనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను తిరిగి విశ్లేషించాము. చిత్రంలో చూపిన విధంగా. చిత్రాలు 2b, 6aలో చూపినట్లుగా, అధిక సాంద్రతలు (200 μM) ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం 6 కలిగిన అగర్ ప్లేట్‌లపై పెరిగిన మొలకల చిన్న మరియు ఎడమ-వక్ర వేళ్లను ఉత్పత్తి చేశాయి (θ = – 23.7 ± 6.1), అయితే నియంత్రణ మాధ్యమంలో పెరిగిన మొలకల మొలకల దాదాపు నేరుగా వేళ్లను ఉత్పత్తి చేశాయి (θ = – 3.8 ± 7.1). ఈ లక్షణమైన వాలుగా పెరుగుదల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ పనిచేయకపోవడం వల్ల సంభవిస్తుందని తెలిసింది. ఈ అన్వేషణకు అనుగుణంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే మందులు డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ మా పెరుగుదల పరిస్థితులలో ఇలాంటి రూట్ టిల్టింగ్‌ను ప్రేరేపించాయి (Figs. 2b, 6a). అదే సమయంలో, మేము ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలను పరీక్షించాము మరియు వాటిలో చాలా వాటిని ఎంచుకున్నాము, అవి కొన్ని సాంద్రతలలో, వాలుగా ఉండే రూట్ పెరుగుదలను ప్రేరేపించాయి. 8, 9, మరియు 15 సమ్మేళనాలు వరుసగా 75 μM, 50 μM మరియు 40 μM వద్ద వేర్ల పెరుగుదల దిశను మార్చాయి, ఈ సమ్మేళనాలు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను సమర్థవంతంగా అస్థిరపరచగలవని సూచిస్తున్నాయి (Fig. 2b, 6a). మేము అత్యంత శక్తివంతమైన ఉర్సోలిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నం KAND 11ని తక్కువ సాంద్రత (15 µM) వద్ద కూడా పరీక్షించాము మరియు KAND 11 యొక్క అప్లికేషన్ వేర్ల పెరుగుదలను నిరోధిస్తుందని మరియు వేర్ల పెరుగుదల దిశ అసమానంగా ఉందని కనుగొన్నాము, అయినప్పటికీ అవి ఎడమ వైపుకు వాలుగా ఉంటాయి (Fig. C3). మైక్రోట్యూబ్యూల్-అస్థిరపరిచే ఔషధాల యొక్క అధిక సాంద్రతలు కొన్నిసార్లు వేర్ల వంపుకు కారణం కాకుండా మొక్కల పెరుగుదలను నిరోధిస్తాయి కాబట్టి, KAND 11 వేర్ల ఎపిడెర్మల్ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను గమనించడం ద్వారా మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేసే అవకాశాన్ని మేము తరువాత అంచనా వేసాము. 25 μM KAND 11 తో చికిత్స చేయబడిన మొలక వేర్ల ఎపిడెర్మల్ కణాలలో యాంటీ-β-ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ పొడుగు జోన్‌లోని ఎపిడెర్మల్ కణాలలో దాదాపు అన్ని కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ అదృశ్యమైనట్లు చూపించింది (Fig. 6b). ఈ ఫలితాలు కుమామోటోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా పనిచేస్తాయని మరియు ఈ సమ్మేళనాలు కొత్త మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్లు అని సూచిస్తున్నాయి.
అరబిడోప్సిస్ థాలియానాలో ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను మారుస్తాయి. (ఎ) సూచించిన సాంద్రతల వద్ద వివిధ ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాల సమక్షంలో మూల వంపు కోణం కొలుస్తారు. మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను నిరోధించే రెండు సమ్మేళనాల ప్రభావాలను కూడా విశ్లేషించారు: డైసోపిరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్. ఇన్‌సెట్ మూల పెరుగుదల కోణాన్ని కొలవడానికి ఉపయోగించే ప్రమాణాన్ని చూపిస్తుంది. ఆస్టరిస్క్‌లు నకిలీ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p< 0.05). n>19. స్కేల్ బార్ = 1 సెం.మీ. (బి) పొడుగు జోన్‌లోని ఎపిడెర్మల్ కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్. 25 μM KAND 11 తో లేదా లేకుండా MS ప్లేట్‌లపై పెరిగిన వైల్డ్-టైప్ అరబిడోప్సిస్ కోల్ రూట్స్‌లోని మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీస్ మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్-కంజుగేటెడ్ సెకండరీ యాంటీబాడీస్ ఉపయోగించి ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ ద్వారా దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి. స్కేల్ బార్ = 10 µm. (సి) రూట్ మెరిస్టెమ్‌లోని మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క మైటోటిక్ నిర్మాణం. ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ ఉపయోగించి మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి. ప్రొఫేస్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్మోప్లాస్ట్‌లతో సహా మైటోటిక్ నిర్మాణాలను కాన్ఫోకల్ చిత్రాల నుండి లెక్కించారు. బాణాలు మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిర్మాణాలను సూచిస్తాయి. ఆస్టరిస్క్‌లు షామ్ చికిత్సతో గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (t పరీక్ష, p< 0.05). n>9. స్కేల్ బార్ = 50 µm.
ఉర్సా మైక్రోట్యూబ్యూల్ పనితీరును అంతరాయం కలిగించే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నప్పటికీ, దాని చర్య యొక్క విధానం సాధారణ మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల నుండి భిన్నంగా ఉంటుందని భావిస్తున్నారు. ఉదాహరణకు, డైసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ వంటి మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ల అధిక సాంద్రతలు ఎపిడెర్మల్ కణాల అనిసోట్రోపిక్ విస్తరణను ప్రేరేపిస్తాయి, అయితే KAND 11 అలా చేయదు. అదనంగా, KAND 11 మరియు డైసోపైరమైడ్ యొక్క సహ-అనువర్తనం ఫలితంగా డైసోపైరమైడ్-ప్రేరిత రూట్ పెరుగుదల ప్రతిస్పందన కలిపింది మరియు KAND 11-ప్రేరిత పెరుగుదల నిరోధం గమనించబడింది (Fig. S4). KAND 11 కు ఉత్పరివర్తన చెందిన హైపర్సెన్సిటివ్ డైసోపైరమైడ్ 1-1 (phs1-1) యొక్క ప్రతిస్పందనను కూడా మేము విశ్లేషించాము. phs1-1 నాన్-కానానికల్ ట్యూబులిన్ కినేస్ పాయింట్ మ్యుటేషన్‌ను కలిగి ఉంటుంది మరియు డైసోపైరమైడ్‌తో చికిత్స చేసినప్పుడు తక్కువ మూలాలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది9,20. KAND 11 కలిగిన అగర్ మాధ్యమంలో పెరిగిన phs1-1 ఉత్పరివర్తన చెందిన మొలకల డైసోపైరమిడ్ (fig. S5) పై పెరిగిన వాటి మాదిరిగానే చిన్న మూలాలను కలిగి ఉంటాయి.
అదనంగా, KAND 11 తో చికిత్స చేయబడిన మొలకల మూల మెరిస్టెమ్‌లో ప్రోఫేస్ జోన్‌లు, స్పిండిల్స్ మరియు ఫ్రాగ్మోప్లాస్ట్‌లు వంటి మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ నిర్మాణాలను మేము గమనించాము. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS కోసం పరిశీలనలకు అనుగుణంగా, మైటోటిక్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ సంఖ్యలో గణనీయమైన తగ్గుదల గమనించబడింది (Fig. .6c).
సబ్ సెల్యులార్ రిజల్యూషన్ వద్ద KAND 11 యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని వర్గీకరించడానికి, మేము పొగాకు BY-2 సస్పెన్షన్ కణాలను KAND 11 తో చికిత్స చేసాము మరియు వాటి ప్రతిస్పందనను గమనించాము. కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై KAND 11 ప్రభావాన్ని అంచనా వేయడానికి, మేము మొదట TagRFP-TUA6 ను వ్యక్తీకరించే BY-2 కణాలకు KAND 11 ను జోడించాము, ఇది ఫ్లోరోసెంట్‌గా మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను లేబుల్ చేస్తుంది. కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ సాంద్రతను ఇమేజ్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి అంచనా వేయబడింది, ఇది సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలిటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించింది. 50 μM లేదా 100 μM KAND 11 తో 1 గంట పాటు చికిత్స తర్వాత, సాంద్రత వరుసగా 0.94 ± 0.74% లేదా 0.23 ± 0.28% కు గణనీయంగా తగ్గిందని పరీక్షా ఫలితాలు చూపించాయి, అయితే DMSO తో చికిత్స చేయబడిన కణాల సాంద్రత 1.61 ± 0.34% (Fig. 7a). ఈ ఫలితాలు అరబిడోప్సిస్‌లోని పరిశీలనకు అనుగుణంగా ఉన్నాయి, KAND 11 చికిత్స కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క డిపోలిమరైజేషన్‌ను ప్రేరేపిస్తుందని (Fig. 6b). KAND 11 యొక్క అదే సాంద్రతతో చికిత్స తర్వాత మేము GFP-ABD-లేబుల్ చేయబడిన ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లతో BY-2 లైన్‌ను కూడా పరిశీలించాము మరియు KAND 11 చికిత్స ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను అంతరాయం కలిగించిందని గమనించాము. 1 గంటకు 50 μM లేదా 100 μM KAND 11 తో చికిత్స ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్ సాంద్రతను వరుసగా 1.20 ± 0.62% లేదా 0.61 ± 0.26%కి గణనీయంగా తగ్గించింది, అయితే DMSO-చికిత్స చేసిన కణాలలో సాంద్రత 1.69 ± 0.51% (Fig. 2). 7b). ఈ ఫలితాలు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను ప్రభావితం చేయని ప్రొపిజామైడ్ మరియు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయని ఆక్టిన్ డిపోలిమరైజర్ లాట్రన్‌కులిన్ B యొక్క ప్రభావాలతో విభేదిస్తాయి (SI ఫిగర్ S6). అదనంగా, కూమమోనామైడ్ 1, కూమమోనామైడ్ యాసిడ్ 6, లేదా KAND 11 తో చికిత్స HeLa కణాలలోని మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను ప్రభావితం చేయలేదు (SI Figure S7). అందువల్ల, KAND 11 యొక్క చర్య యొక్క విధానం తెలిసిన సైటోస్కెలిటన్ డిస్ట్రప్టర్ల నుండి భిన్నంగా ఉంటుందని నమ్ముతారు. అదనంగా, KAND 11 తో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాల యొక్క మా సూక్ష్మ పరిశీలన KAND 11 చికిత్స సమయంలో కణాల మరణం ప్రారంభమైనట్లు వెల్లడించింది మరియు Evans బ్లూ-స్టెయిన్డ్ డెడ్ సెల్స్ నిష్పత్తి KAND 11 చికిత్స యొక్క 30 నిమిషాల తర్వాత గణనీయంగా పెరగలేదని చూపించింది, అయితే 50 μM లేదా 100 μM KAND తో 90 నిమిషాల చికిత్స తర్వాత, చనిపోయిన కణాల సంఖ్య వరుసగా 43.7% లేదా 80.1%కి పెరిగింది (Fig. 7c). కలిసి తీసుకుంటే, ఈ డేటా నవల ఉర్సోలిక్ యాసిడ్ ఉత్పన్నం KAND 11 అనేది గతంలో తెలియని చర్య విధానంతో కూడిన మొక్క-నిర్దిష్ట సైటోస్కెలిటల్ ఇన్హిబిటర్ అని సూచిస్తుంది.
KAND కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్, ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ మరియు పొగాకు BY-2 కణాల యొక్క సాధ్యతను ప్రభావితం చేస్తుంది. (ఎ) TagRFP-TUA6 సమక్షంలో BY-2 కణాలలో కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క దృశ్యమానత. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSO తో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలను కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు. కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ సాంద్రతను 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి లెక్కించారు. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p< 0.05). స్కేల్ బార్ = 10 µm. (b) GFP-ABD2 సమక్షంలో దృశ్యమానం చేయబడిన BY-2 కణాలలోని కార్టికల్ ఆక్టిన్ తంతువులు. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSOతో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలను కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు. కార్టికల్ ఆక్టిన్ తంతువుల సాంద్రతను 25 స్వతంత్ర కణాల మైక్రోగ్రాఫ్‌ల నుండి లెక్కించారు. అక్షరాలు గణనీయమైన తేడాలను సూచిస్తాయి (టుకే HSD పరీక్ష, p< 0.05). స్కేల్ బార్ = 10 µm. (సి) ఎవాన్స్ బ్లూ స్టెయినింగ్ ద్వారా చనిపోయిన BY-2 కణాల పరిశీలన. KAND 11 (50 μM లేదా 100 μM) లేదా DMSOతో చికిత్స చేయబడిన BY-2 కణాలను ప్రకాశవంతమైన-క్షేత్ర సూక్ష్మదర్శిని ద్వారా పరిశీలించారు. n=3. స్కేల్ బార్ = 100 µm.
కొత్త సహజ ఉత్పత్తుల ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం వైద్యం మరియు వ్యవసాయం సహా మానవ జీవితంలోని వివిధ అంశాలలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీసింది. సహజ వనరుల నుండి ఉపయోగకరమైన సమ్మేళనాలను పొందేందుకు చారిత్రక పరిశోధనలు జరిగాయి. ముఖ్యంగా, ఆక్టినోమైసెట్‌లు నెమటోడ్‌లకు యాంటీపరాసిటిక్ యాంటీబయాటిక్స్‌గా ఉపయోగపడతాయని తెలిసింది ఎందుకంటే అవి అవెర్మెక్టిన్, ఐవర్‌మెక్టిన్ మరియు బ్లోమైసిన్ యొక్క సీస సమ్మేళనం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు వంటి వివిధ ద్వితీయ జీవక్రియలను ఉత్పత్తి చేయగలవు, వీటిని క్యాన్సర్ నిరోధక ఏజెంట్‌గా వైద్యపరంగా ఉపయోగిస్తారు21,22. అదేవిధంగా, ఆక్టినోమైసెట్‌ల నుండి వివిధ రకాల కలుపు సంకలనాలు కనుగొనబడ్డాయి, వాటిలో కొన్ని ఇప్పటికే వాణిజ్యపరంగా ఉపయోగించబడుతున్నాయి1,23. అందువల్ల, కావలసిన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో సహజ ఉత్పత్తులను వేరుచేయడానికి ఆక్టినోమైసెట్ జీవక్రియల విశ్లేషణ ప్రభావవంతమైన వ్యూహంగా పరిగణించబడుతుంది. ఈ అధ్యయనంలో, మేము S. వెర్రెన్సిస్ నుండి కొత్త సమ్మేళనం, కూమమోనామైడ్‌ను కనుగొన్నాము మరియు దానిని విజయవంతంగా సంశ్లేషణ చేసాము. ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం ఉర్బెనమైడ్ మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క సింథటిక్ ఇంటర్మీడియట్. ఇది లక్షణమైన రూట్ కర్లింగ్‌కు కారణమవుతుంది, మితమైన నుండి బలమైన కలుపు సంహారక చర్యను ప్రదర్శిస్తుంది మరియు ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్‌లను దెబ్బతీస్తుంది. అయితే, ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్య యొక్క యంత్రాంగం ఇప్పటికే ఉన్న మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఇన్హిబిటర్ల చర్య నుండి భిన్నంగా ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే KAND 11 కూడా ఆక్టిన్ తంతువులను అంతరాయం కలిగిస్తుంది మరియు కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది, ఇది ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు విస్తృత శ్రేణి సైటోస్కెలిటల్ నిర్మాణాలను ప్రభావితం చేసే నియంత్రణ యంత్రాంగాన్ని సూచిస్తుంది.
ఉర్బెనోనిక్ ఆమ్లం యొక్క మరింత వివరణాత్మక లక్షణం ఉర్బెనోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్య యొక్క యంత్రాంగాన్ని బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది. ముఖ్యంగా, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం తగ్గిన మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌తో బంధించే సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడం తదుపరి లక్ష్యం, ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌పై నేరుగా పనిచేస్తాయా మరియు వాటిని డిపాలిమరైజ్ చేస్తాయా లేదా వాటి చర్య మైక్రోట్యూబ్యూల్ అస్థిరతకు దారితీస్తుందా అని నిర్ణయించడం. అదనంగా, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ ప్రత్యక్ష లక్ష్యం కానప్పుడు, మొక్క కణాలపై ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క చర్య యొక్క ప్రదేశం మరియు పరమాణు లక్ష్యాలను గుర్తించడం సంబంధిత సమ్మేళనాల లక్షణాలను మరియు కలుపు సంహారక కార్యకలాపాలను మెరుగుపరచడానికి సాధ్యమయ్యే మార్గాలను మరింత అర్థం చేసుకోవడానికి సహాయపడుతుంది. మా బయోయాక్టివిటీ అస్సే అరబిడోప్సిస్ థాలియానా, పొగాకు మరియు లివర్‌వోర్ట్ వంటి మొక్కల పెరుగుదలపై ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క ప్రత్యేకమైన సైటోటాక్సిక్ సామర్థ్యాన్ని వెల్లడించింది, అయితే E. కోలి లేదా హెలా కణాలు ప్రభావితం కాలేదు. బహిరంగ వ్యవసాయ క్షేత్రాలలో ఉపయోగం కోసం కలుపు సంహారకాలుగా అభివృద్ధి చేయబడితే జంతు కణాలకు తక్కువ లేదా ఎటువంటి విషపూరితం ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాల ప్రయోజనం. నిజానికి, యూకారియోట్లలో మైక్రోట్యూబుల్స్ సాధారణ నిర్మాణాలు కాబట్టి, మొక్కలలో వాటి ఎంపిక నిరోధం కలుపు మందులకు కీలకమైన అవసరం. ఉదాహరణకు, ట్యూబులిన్‌తో నేరుగా బంధించి పాలిమరైజేషన్‌ను నిరోధించే మైక్రోట్యూబ్యూల్ డిపోలిమరైజింగ్ ఏజెంట్ అయిన ప్రొపిజామైడ్, జంతు కణాలకు దాని తక్కువ విషపూరితం కారణంగా కలుపు మందుల సంహారకంగా ఉపయోగించబడుతుంది24. డిస్పోపైరమైడ్‌కు విరుద్ధంగా, సంబంధిత బెంజామైడ్‌లు వేర్వేరు లక్ష్య ప్రత్యేకతలను కలిగి ఉంటాయి. మొక్కల మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌తో పాటు, RH-4032 లేదా బెంజోక్సమైడ్ వరుసగా జంతు కణాలు లేదా ఓమైసెట్‌ల మైక్రోట్యూబ్యూల్‌లను కూడా నిరోధిస్తుంది మరియు జాలిలామైడ్ దాని తక్కువ ఫైటోటాక్సిసిటీ కారణంగా శిలీంద్ర సంహారిణిగా ఉపయోగించబడుతుంది25,26,27. కొత్తగా కనుగొనబడిన ఎలుగుబంటి మరియు దాని ఉత్పన్నాలు మొక్కలకు వ్యతిరేకంగా ఎంపిక చేసిన సైటోటాక్సిసిటీని ప్రదర్శిస్తాయి, అయితే తదుపరి మార్పులు వాటి లక్ష్య విశిష్టతను మార్చవచ్చని, వ్యాధికారక శిలీంధ్రాలు లేదా ఓమైసెట్‌ల నియంత్రణకు అదనపు ఉత్పన్నాలను అందించగలవని గమనించాలి.
అర్బెనోనిక్ ఆమ్లం మరియు దాని ఉత్పన్నాల యొక్క ప్రత్యేక లక్షణాలు కలుపు సంహారకాలుగా అభివృద్ధి చెందడానికి మరియు పరిశోధన సాధనాలుగా ఉపయోగించడానికి ఉపయోగపడతాయి. మొక్క కణ ఆకారాన్ని నియంత్రించడంలో సైటోస్కెలిటన్ యొక్క ప్రాముఖ్యత విస్తృతంగా గుర్తించబడింది. మైక్రోట్యూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను సరిగ్గా నియంత్రించడానికి మొక్కలు కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఆర్గనైజేషన్ యొక్క సంక్లిష్ట విధానాలను అభివృద్ధి చేశాయని మునుపటి అధ్యయనాలు చూపించాయి. మైక్రోట్యూబ్యూల్ కార్యకలాపాల నియంత్రణకు బాధ్యత వహించే పెద్ద సంఖ్యలో అణువులను గుర్తించారు మరియు సంబంధిత పరిశోధన ఇప్పటికీ కొనసాగుతోంది3,4,28. మొక్క కణాలలో మైక్రోట్యూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌పై మన ప్రస్తుత అవగాహన కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్ ఆర్గనైజేషన్ యొక్క విధానాలను పూర్తిగా వివరించలేదు. ఉదాహరణకు, డిసోపైరమైడ్ మరియు ఒరిజాలిన్ రెండూ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను డిపోలిమరైజ్ చేయగలిగినప్పటికీ, డిసోపైరమైడ్ తీవ్రమైన రూట్ వక్రీకరణకు కారణమవుతుంది, అయితే ఒరిజాలిన్ సాపేక్షంగా తేలికపాటి ప్రభావాన్ని కలిగి ఉంటుంది. అంతేకాకుండా, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్‌ను స్థిరీకరించే ట్యూబులిన్‌లోని ఉత్పరివర్తనలు కూడా వేళ్లలో డెక్స్ట్రోరోటేషన్‌కు కారణమవుతాయి, అయితే మైక్రోట్యూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను కూడా స్థిరీకరించే పాక్లిటాక్సెల్ అలా చేయదు. అందువల్ల, ఉర్సోలిక్ ఆమ్లం యొక్క పరమాణు లక్ష్యాలను అధ్యయనం చేయడం మరియు గుర్తించడం మొక్కల కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ నియంత్రణపై కొత్త అంతర్దృష్టులను అందించాలి. అదేవిధంగా, వక్రీకరించిన పెరుగుదలను ప్రోత్సహించడంలో ప్రభావవంతమైన డిసోపిరమైడ్ వంటి రసాయనాలు మరియు ఒరిజాలిన్ లేదా కుమామోటోరిక్ ఆమ్లం వంటి తక్కువ ప్రభావవంతమైన రసాయనాల భవిష్యత్తు పోలికలు వక్రీకరించిన పెరుగుదల ఎలా జరుగుతుందో ఆధారాలను అందిస్తాయి.
మరోవైపు, రక్షణ-సంబంధిత సైటోస్కెలిటల్ పునర్వ్యవస్థీకరణలు ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క సైటోటాక్సిసిటీని వివరించడానికి మరొక అవకాశం. వ్యాధికారక సంక్రమణ లేదా మొక్క కణాలలోకి ఎలిసిటర్‌ను ప్రవేశపెట్టడం కొన్నిసార్లు సైటోస్కెలిటన్ నాశనం మరియు తదుపరి కణాల మరణానికి కారణమవుతుంది29. ఉదాహరణకు, ఓమైసెట్-ఉత్పన్నమైన క్రిప్టోక్సంతిన్ పొగాకు కణ మరణానికి ముందు మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మరియు ఆక్టిన్ తంతువులను అంతరాయం కలిగిస్తుందని నివేదించబడింది, ఇది KAND చికిత్సతో జరిగే మాదిరిగానే30,31. ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం ద్వారా ప్రేరేపించబడిన రక్షణ ప్రతిస్పందనలు మరియు సెల్యులార్ ప్రతిస్పందనల మధ్య సారూప్యతలు అవి సాధారణ సెల్యులార్ ప్రక్రియలను ప్రేరేపిస్తాయని పరికల్పన చేయడానికి దారితీశాయి, అయినప్పటికీ క్రిప్టోక్సంతిన్ కంటే ఉర్సోనిక్ ఆమ్లం యొక్క వేగవంతమైన మరియు బలమైన ప్రభావం స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది. అయితే, ఆక్టిన్ తంతువుల అంతరాయం ఆకస్మిక కణ మరణాన్ని ప్రోత్సహిస్తుందని అధ్యయనాలు చూపించాయి, ఇది ఎల్లప్పుడూ మైక్రోట్యూబ్యూల్ అంతరాయంతో కలిసి ఉండదు29. అదనంగా, ఉర్సోనిక్ ఆమ్ల ఉత్పన్నాలు చేసినట్లుగా, వ్యాధికారక లేదా ఎలిసిటర్ వక్రీకరించిన మూల పెరుగుదలకు కారణమవుతుందో లేదో చూడాలి. అందువల్ల, రక్షణ ప్రతిస్పందనలను మరియు సైటోస్కెలిటన్‌ను అనుసంధానించే పరమాణు జ్ఞానం పరిష్కరించాల్సిన ఆకర్షణీయమైన సమస్య. ఉర్సోనిక్ ఆమ్లానికి సంబంధించిన తక్కువ పరమాణు బరువు సమ్మేళనాల ఉనికిని, అలాగే వివిధ శక్తితో కూడిన ఉత్పన్నాల శ్రేణిని ఉపయోగించడం ద్వారా, అవి తెలియని సెల్యులార్ విధానాలను లక్ష్యంగా చేసుకునే అవకాశాలను అందించవచ్చు.
కలిసి చూస్తే, మైక్రోట్యూబ్యూల్ డైనమిక్స్‌ను మాడ్యులేట్ చేసే కొత్త సమ్మేళనాల ఆవిష్కరణ మరియు అనువర్తనం మొక్క కణ ఆకార నిర్ధారణకు అంతర్లీనంగా ఉన్న సంక్లిష్ట పరమాణు విధానాలను పరిష్కరించడానికి శక్తివంతమైన పద్ధతులను అందిస్తుంది. ఈ సందర్భంలో, మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ మరియు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లను ప్రభావితం చేసే మరియు కణాల మరణాన్ని ప్రేరేపించే ఇటీవల అభివృద్ధి చేయబడిన సమ్మేళనం ఉర్మోటోనిక్ ఆమ్లం, మైక్రోట్యూబ్యూల్ నియంత్రణ మరియు ఈ ఇతర విధానాల మధ్య సంబంధాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి అవకాశాన్ని అందిస్తుంది. అందువల్ల, ఉర్బెనోనిక్ ఆమ్లాన్ని ఉపయోగించి రసాయన మరియు జీవ విశ్లేషణ మొక్క సైటోస్కెలిటన్‌ను నియంత్రించే పరమాణు నియంత్రణ విధానాలను అర్థం చేసుకోవడానికి మాకు సహాయపడుతుంది.
2% (w/v) గెలాక్టోస్, 2% (w/v) ఎసెన్స్ పేస్ట్, 1% (w/v) బాక్టో కూర్పుతో కూడిన 110 mL విత్తన మాధ్యమం కలిగిన 500 mL బాఫిల్డ్ ఎర్లెన్‌మేయర్ ఫ్లాస్క్‌లో S. వెర్రెన్సిస్ MK493-CF1 ను టీకాలు వేయండి. -సోయ్టన్ (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, ఇంక్.), 0.5% (w/v) మొక్కజొన్న సారం (KOGOSCH కో., లిమిటెడ్, జపాన్), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 మరియు 0.2% CaCO3 లను డీయోనైజ్డ్ నీటిలో వేయండి. (స్టెరిలైజేషన్ ముందు pH 7.4). విత్తన సంస్కృతులను రోటరీ షేకర్ (180 rpm) పై 2 రోజుల పాటు 27°C వద్ద పొదిగించారు. ఘన స్థితి కిణ్వ ప్రక్రియ ద్వారా ఉత్పత్తి సాగు. విత్తన సంస్కృతి (7 మి.లీ) 15 గ్రాముల నొక్కిన బార్లీ (MUSO Co., Ltd., జపాన్) మరియు 25 గ్రాముల డీయోనైజ్డ్ నీరు (స్టెరిలైజేషన్ ముందు సర్దుబాటు చేయబడలేదు) కలిగిన 40 గ్రాముల ఉత్పత్తి మాధ్యమం కలిగిన 500 మి.లీ K-1 ఫ్లాస్క్‌లోకి బదిలీ చేయబడింది. 14 రోజుల పాటు చీకటిలో 30°C వద్ద కిణ్వ ప్రక్రియ జరిగింది. కిణ్వ ప్రక్రియ పదార్థాన్ని 40 ml/బాటిల్ EtOHతో సంగ్రహించి సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు (1500 గ్రా, 4°C, 10 నిమిషాలు). కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ (60 మి.లీ) 10% MeOH/EtOAc మిశ్రమంతో సంగ్రహించారు. తగ్గిన ఒత్తిడిలో అవశేషాన్ని (59.5 mg) పొందడానికి సేంద్రీయ పొరను ఆవిరి చేశారు, దీనిని రివర్స్ ఫేజ్ కాలమ్‌పై గ్రేడియంట్ ఎల్యూషన్ (0–10 నిమిషాలు: 90%)తో HPLCకి గురిచేసి (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × పొడవు 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 నిమిషాలు: 90% H2O/CH3CN నుండి 70% H2O/CH3CN (గ్రేడియంట్), 35–45 నిమిషాలు: 90% H2O/EtOH, 45–155 నిమిషాలు: 90% H2O/EtOH నుండి 100% EtOH (గ్రేడియంట్ (గ్రేడియంట్), 155–200 నిమిషాలు: 100% EtOH) 1.5 ml/min ప్రవాహం రేటుతో, కూమమోనామైడ్ (1, 36.0 mg) తెల్లని అస్ఫారక పొడిగా వేరుచేయబడింది.
కుమామోటోఅమైడ్(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ లెక్కించిన విలువ: 141.0659, కొలిచిన విలువ: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 సెం.మీ–1.
కొలంబియా విత్తనాలను (Col-0) అరబిడోప్సిస్ బయోలాజికల్ రిసోర్స్ సెంటర్ (ABRC) నుండి పరిశోధన ఉపయోగం కోసం అనుమతితో పొందారు. కోల్-0 విత్తనాలను మా ప్రయోగశాల పరిస్థితులలో ప్రచారం చేసి నిర్వహించారు మరియు అడవి-రకం అరబిడోప్సిస్ మొక్కలుగా ఉపయోగించారు. అరబిడోప్సిస్ విత్తనాలను ఉపరితల క్రిమిరహితం చేసి, సగం బలం కలిగిన మురాషిగే మరియు స్కూగ్ మాధ్యమంలో 2% సుక్రోజ్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), 0.05% (w/v) 2-(4-మోర్ఫోలినో) ఇథనేసల్ఫోనిక్ ఆమ్లం (MES) (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) మరియు 1.5% అగర్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్), pH 5.7, 23 °C మరియు స్థిరమైన కాంతి వద్ద అందించారు. phs1-1 ఉత్పరివర్తన విత్తనాలను T. హషిమోటో (నారా ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు.
SR-1 జాతి విత్తనాలను టి. హషిమోటో (నారా ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ సైన్స్ అండ్ టెక్నాలజీ) అందించారు మరియు వాటిని అడవి-రకం పొగాకు మొక్కలుగా ఉపయోగించారు. పొగాకు విత్తనాలను ఉపరితల క్రిమిరహితం చేసి, అంకురోత్పత్తిని ప్రోత్సహించడానికి మూడు రాత్రులు శుభ్రమైన నీటిలో నానబెట్టారు, తరువాత 2% సుక్రోజ్, 0.05% (w/v) MES, మరియు 0.8% గెల్లాన్ గమ్ (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) మురాషిగే. మరియు స్కూగ్ మీడియం) కలిగిన సగం-శక్తి ద్రావణంలో pH 5.7 తో ఉంచారు మరియు స్థిరమైన కాంతిలో 23°C వద్ద పొదిగించారు.
స్ట్రెయిన్ టాక్-1 ను టి. కోచి (క్యోటో విశ్వవిద్యాలయం) అందించారు మరియు దీనిని లివర్‌వోర్ట్ అధ్యయనం కోసం ప్రామాణిక ప్రయోగాత్మక యూనిట్‌గా ఉపయోగించారు. జెమ్మాను క్రిమిరహితం చేసిన కల్చర్డ్ మొక్కల నుండి పొందారు మరియు తరువాత 1% సుక్రోజ్ మరియు 0.3% గెల్లాన్ గమ్ కలిగిన గాంబోర్గ్ B5 మాధ్యమం (ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) పై పూత పూసి, నిరంతర కాంతి కింద 23°C వద్ద పొదిగించారు.
పొగాకు BY-2 కణాలు (నికోటియానా టాబాకమ్ L. cv. బ్రైట్ ఎల్లో 2) S. హసేజావా (టోక్యో విశ్వవిద్యాలయం) ద్వారా అందించబడ్డాయి. BY-2 కణాలను సవరించిన లిన్స్మీర్ మరియు స్కూగ్ మాధ్యమంలో 95 రెట్లు కరిగించి, వారానికి 2,4-డైక్లోరోఫెనాక్సీయాసిటిక్ ఆమ్లం 32 తో భర్తీ చేశారు. చీకటిలో 27°C వద్ద 130 rpm వద్ద రోటరీ షేకర్‌పై సెల్ సస్పెన్షన్ కలపబడింది. తాజా మాధ్యమం యొక్క 10 రెట్లు వాల్యూమ్‌తో కణాలను కడిగి, అదే మాధ్యమంలో తిరిగి అమర్చండి. కాలీఫ్లవర్ మొజాయిక్ వైరస్ 35S ప్రమోటర్ కింద మైక్రోట్యూబ్యూల్ మార్కర్ TagRFP-TUA6 లేదా ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్ మార్కర్ GFP-ABD2 ని స్థిరంగా వ్యక్తీకరించే BY-2 ట్రాన్స్‌జెనిక్ సెల్ లైన్లు వివరించిన విధంగా ఉత్పత్తి చేయబడ్డాయి33,34,35. ఈ సెల్ లైన్‌లను అసలు BY-2 సెల్ లైన్ కోసం ఉపయోగించిన విధానాలకు సమానమైన విధానాలను ఉపయోగించి నిర్వహించవచ్చు మరియు సమకాలీకరించవచ్చు.
5% CO2 తో 37°C ఇంక్యుబేటర్‌లో 10% ఫీటల్ బోవిన్ సీరం, 1.2 U/ml పెన్సిలిన్ మరియు 1.2 μg/ml స్ట్రెప్టోమైసిన్‌తో అనుబంధంగా డల్బెకో యొక్క మోడిఫైడ్ ఈగల్స్ మీడియం (DMEM) (లైఫ్ టెక్నాలజీస్)లో HeLa కణాలు కల్చర్ చేయబడ్డాయి.
ఈ మాన్యుస్క్రిప్ట్‌లో వివరించిన అన్ని ప్రయోగాలు జపనీస్ జీవ భద్రత నిబంధనలు మరియు మార్గదర్శకాలకు అనుగుణంగా జరిగాయి.
సమ్మేళనాలను డైమిథైల్ సల్ఫాక్సైడ్ (DMSO; ఫుజిఫిల్మ్ వాకో ప్యూర్ కెమికల్) లో స్టాక్ సొల్యూషన్లుగా కరిగించి, అరబిడోప్సిస్ కోసం MS మాధ్యమంలో మరియు లివర్‌వోర్ట్ కోసం పొగాకు లేదా గాంబోర్గ్ B5 మాధ్యమంలో కరిగించారు. రూట్ గ్రోత్ ఇన్హిబిషన్ అస్సే కోసం, సూచించిన సమ్మేళనాలు లేదా DMSO ఉన్న అగర్ మాధ్యమంలో ప్లేట్‌కు 10 కంటే ఎక్కువ విత్తనాలను నాటారు. విత్తనాలను 7 రోజుల పాటు గ్రోత్ చాంబర్‌లో పొదిగించారు. మొలకల ఫోటో తీయబడింది మరియు వేర్ల పొడవును కొలుస్తారు. అరబిడోప్సిస్ అంకురోత్పత్తి అస్సే కోసం, ప్లేట్‌కు 48 విత్తనాలను 200 μM సమ్మేళనం లేదా DMSO ఉన్న అగర్ మాధ్యమంలో నాటారు. అరబిడోప్సిస్ విత్తనాలను గ్రోత్ చాంబర్‌లో పెంచారు మరియు మొలకెత్తిన మొలకల సంఖ్యను అంకురోత్పత్తి తర్వాత 7 రోజుల తర్వాత లెక్కించారు (డాగ్). పొగాకు అంకురోత్పత్తి అస్సే కోసం, ప్లేట్‌కు 24 విత్తనాలను 200 μM KAND లేదా DMSO ఉన్న అగర్ మాధ్యమంలో నాటారు. పొగాకు విత్తనాలను గ్రోత్ చాంబర్‌లో పెంచారు మరియు 14 రోజుల తర్వాత మొలకెత్తిన మొలకల సంఖ్యను లెక్కించారు. లివర్‌వోర్ట్ పెరుగుదల నిరోధక పరీక్ష కోసం, ప్రతి ప్లేట్ నుండి 9 పిండాలను సూచించిన KAND లేదా DMSO సాంద్రతలను కలిగి ఉన్న అగర్ మాధ్యమంపై పూత పూసి, 14 రోజుల పాటు గ్రోత్ చాంబర్‌లో పొదిగించారు.
రూట్ మెరిస్టెమ్ ఆర్గనైజేషన్‌ను దృశ్యమానం చేయడానికి 5 mg/ml ప్రొపిడియం అయోడైడ్ (PI) తో తడిసిన మొలకలను ఉపయోగించండి. TCS SPE కన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా PI సిగ్నల్స్ గమనించబడ్డాయి.
మలామి మరియు బెన్ఫే36 వివరించిన ప్రోటోకాల్ ప్రకారం వేర్లకు హిస్టోకెమికల్ స్టెయినింగ్ β-గ్లూకురోనిడేస్ (GUS) తో నిర్వహించారు. మొలకలను రాత్రిపూట 90% అసిటోన్‌లో స్థిరపరిచి, GUS బఫర్‌లో 0.5 mg/ml 5-బ్రోమో-4-క్లోరో-3-ఇండోలైల్-β-d-గ్లూకురోనిక్ ఆమ్లంతో 1 గంట పాటు స్టెయిన్ చేసి, హైడ్రేటెడ్ క్లోరల్డిహైడ్ ద్రావణంలో ఉంచారు. (8 గ్రా క్లోరల్ హైడ్రేట్, 2 మి.లీ నీరు మరియు 1 మి.లీ గ్లిసరాల్) మరియు ఆక్సియో ఇమేజర్ M1 మైక్రోస్కోప్ (కార్ల్ జీస్) ఉపయోగించి డిఫరెన్షియల్ ఇంటర్‌ఫెరెన్స్ కాంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ ద్వారా పరిశీలించారు.
నిలువుగా ఉంచిన పలకలపై పెరిగిన 7 రోజుల వయస్సు గల మొలకలపై వేర్ల కోణాలను కొలుస్తారు. 6వ దశలో వివరించిన విధంగా గురుత్వాకర్షణ వెక్టర్ దిశ నుండి వేర్ల కోణాన్ని కొలవండి.
ప్రోటోకాల్ 37 కు స్వల్ప మార్పులతో, కార్టికల్ మైక్రోట్యూబ్యూల్స్ యొక్క అమరిక వివరించిన విధంగా గమనించబడింది. యాంటీ-β-ట్యూబులిన్ యాంటీబాడీ (KMX-1, మెర్క్ మిల్లిపోర్: MAB3408) మరియు అలెక్సా ఫ్లోర్ 488-కంజుగేటెడ్ యాంటీ-మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A32723) లను వరుసగా 1:1000 మరియు 1:100 డైల్యూషన్ల వద్ద ప్రాథమిక మరియు ద్వితీయ యాంటీబాడీలుగా ఉపయోగించారు. TCS SPE కన్ఫోకల్ లేజర్ స్కానింగ్ మైక్రోస్కోప్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ చిత్రాలను పొందారు. Z-స్టాక్ చిత్రాలను పొందండి మరియు తయారీదారు సూచనల ప్రకారం గరిష్ట తీవ్రత అంచనాలను సృష్టించండి.
తయారీదారు సూచనల మేరకు సెల్ కౌంటింగ్ కిట్ 8 (డోజిండో) ఉపయోగించి హెలా సెల్ విస్తరణ పరీక్ష జరిగింది.
600 nm (OD600) వద్ద స్పెక్ట్రోఫోటోమీటర్ ఉపయోగించి కల్చర్‌లో కణ సాంద్రతను కొలవడం ద్వారా E. coli DH5α పెరుగుదలను విశ్లేషించారు.
ట్రాన్స్‌జెనిక్ BY-2 కణాలలో సైటోస్కెలిటల్ ఆర్గనైజేషన్‌ను CSU-X1 కన్ఫోకల్ స్కానింగ్ పరికరం (యోకోగావా) మరియు sCMOS కెమెరా (జైలా, అండోర్ టెక్నాలజీ)తో కూడిన ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోప్‌ను ఉపయోగించి పరిశీలించారు. ఇమేజ్ విశ్లేషణ ద్వారా సైటోస్కెలిటల్ సాంద్రతను అంచనా వేశారు, ఇది ఇమేజ్‌జే సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి కాన్ఫోకల్ ఇమేజ్‌లలో సైటోప్లాస్మిక్ పిక్సెల్‌లలో సైటోస్కెలిటల్ పిక్సెల్‌ల శాతాన్ని లెక్కించింది38,39.
BY-2 కణాలలో కణాల మరణాన్ని గుర్తించడానికి, సెల్ సస్పెన్షన్ యొక్క ఒక భాగాన్ని గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 0.05% ఎవాన్స్ బ్లూతో 10 నిమిషాలు పొదిగించారు. చనిపోయిన కణాల యొక్క సెలెక్టివ్ ఎవాన్స్ బ్లూ స్టెయినింగ్ చెక్కుచెదరకుండా ఉన్న ప్లాస్మా పొర ద్వారా ఆచరణీయ కణాల నుండి రంగును బయటకు తీయడంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ప్రకాశవంతమైన-క్షేత్ర సూక్ష్మదర్శిని (BX53, ఒలింపస్) ఉపయోగించి మరకలు పడిన కణాలను పరిశీలించారు.
37°C మరియు 5% CO2 వద్ద తేమతో కూడిన ఇంక్యుబేటర్‌లో 10% FBSతో అనుబంధంగా DMEMలో HeLa కణాలను పెంచారు. కణాలను 37°C వద్ద 6 గంటలకు 100 μM KAND 11, కుమామోనామిక్ ఆమ్లం 6, కుమామోనామైడ్ 1, 100 ng/ml కోల్సెమిడ్ (గిబ్కో), లేదా 100 ng/ml నోకోడ్మేజ్ (సిగ్మా)తో చికిత్స చేశారు. కణాలను 10 నిమిషాలు MetOHతో మరియు తరువాత గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 5 నిమిషాలు అసిటేట్‌తో స్థిరపరిచారు. స్థిర కణాలను 0.5% BSA/PBSలో కరిగించిన β-ట్యూబులిన్ ప్రైమరీ యాంటీబాడీ (1D4A4, ప్రోటీన్‌టెక్: 66240-1)తో 2 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు, TBSTతో 3 సార్లు కడిగి, ఆపై అలెక్సా ఫ్లోర్ మేక యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. 488 1 గంట. – మౌస్ IgG (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్: A11001) మరియు 15 ng/ml 4′,6-డయామిడినో-2-ఫెనిలిండోల్ (DAPI) 0.5% BSA/PBSలో కరిగించబడ్డాయి. TBSTతో మూడుసార్లు కడిగిన తర్వాత, నికాన్ ఎక్లిప్స్ Ti-E విలోమ మైక్రోస్కోప్‌లో మరకలు పడిన కణాలు గమనించబడ్డాయి. మెటామార్ఫ్ సాఫ్ట్‌వేర్ (మాలిక్యులర్ డివైజెస్) ఉపయోగించి చల్లబడిన హమామాట్సు ORCA-R2 CCD కెమెరాతో చిత్రాలు సంగ్రహించబడ్డాయి.